液體樣品中雌激素活性物質檢測方法概述

唐語謙，王諳，朋賢，余以剛，李曉鳳，*

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640；2.華南理工大學制漿造紙國家重點實驗室，廣東 廣州 510640）

雌激素及雌激素類化合物是廣泛存在于人體、家禽、農產品、廢水處理廠、工業生產廠及自然環境中的一種類固醇類物質，主要可分為環境雌激素和內源性雌激素。雌激素具有促進雌性動物第二性征發育及性器官成熟等生理作用，也是脂質代謝、炎癥和血管各指數穩定的重要調節劑。研究表明內源性雌激素可以有效降低絕經前女性動脈粥硬化性血管疾病的發生，絕經后的女性通過雌激素藥物維持體內的雌激素水平可以有效降低心血管類疾病的風險[1]。但同時，雌激素及雌激素類化合物在機體內的代謝、運轉和積累都會對人類健康、動植物安全性造成一系列的問題，包括引起小孩的性早熟、生理功能發育異常及引發成人的乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和生殖異常等。

在關于雌激素及其代謝物對絕經前和絕經后的女性的作用研究中，結果表明內源性雌激素對乳腺癌的發展起到了關鍵作用[2]。Key 等[3]匯總分析了9 項雌激素物質對663 名女性中未接觸過外源性雌激素情況下患有乳腺癌的女性的影響，結果表明隨著雌激素水平的上升，患乳腺癌的風險明顯增加。Fuhrman 等[4]分別研究了15 種雌激素和雌激素代謝物的循環水平與代謝途徑對乳腺癌風險的相關性，研究顯示患乳腺癌的風險與雌二醇水平呈正相關。大量數據表明雌激素會也增大男性患前列腺癌的幾率。Qin 等[5]調查了不同地區牛奶中雌激素的含量和居民牛奶攝入量及該地區男性患前列腺癌的人數，數據顯示西方以雌激素含量較高的牛奶、乳制品為主食的地區造成了其男性更高的前列腺癌發生率。Kosti 等[6]研究了尿液中的雌激素和雌激素代謝物對引起前列腺癌的影響，發現在所有的雌激素代謝物濃度中，前列腺癌患者的兒茶酚雌激素濃度高于健康男性。Carlo 等[7]評估了男性視網膜上皮細胞中性類固醇激素波動，結果表明性類固醇波動是視網膜環境變化的誘導因素，能引起眼睛老化等生理問題。

目前在工業生產中，雌激素因對糖類、脂質、蛋白質等營養物質的合成起到重要作用而廣泛應用于動物飼料、食品、化妝品中，功能發揮后多余的雌激素往往會通過食物鏈直接或間接進入到人體，直接傷害人類健康[8]，并且一些公司為了節省商品制作成本，直接選擇忽略飼料及食品中的雌激素含量，造成了頻繁的雌激素污染事件。此外，在糧食中污染最嚴重的霉菌毒素之一——玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）作為雌激素的結構類似物具有雌激素樣作用，能造成動物急慢性中毒，引起繁殖機能異常甚至死亡，給畜牧場造成巨大經濟損失并危害食用人群的健康。針對當下現狀，雌激素檢測手段的重要性不言而喻，本文總結了一些針對液態環境常用的雌激素檢測方法，重點介紹近幾年發展的轉基因生物反應器在雌激素檢測方面的應用。

1 轉基因生物（genetically modified organism，GMO）反應器

轉基因生物反應器是利用微生物細胞通過基因工程技術手段將外源基因轉化到受體中進行高效表達，從而獲得具有重要應用價值的表達產物的生命系統。目前關于該方法的研究中使用的表達載體主要為酵母細胞，使用的外源基因主要是β-半乳糖苷酶（LacZ 基因）、綠色熒光蛋白（yEGFP 基因）和熒光素酶（Luc 基因）等。

Black 等[9]基于LacZ 基因構建了酵母雌激素篩選系統，如圖1所示。

圖1 雙質粒重組酵母系統Fig.1 Double plasmid recombinant yeast system

該系統將人體雌激素受體（human estrogen receptor，hERα）和攜帶雌激素反應元件（estrogen response element，ERE）的表達質粒一起整合到釀酒酵母細胞中，其中ERE 控制報告基因β-半乳糖苷酶的表達，在檢測環境含有雌激素活性的化學物質的情況下，酵母細胞分泌的β-半乳糖苷酶分解培養基中的顯色底物氯酚紅β-D-吡喃半乳糖苷（chlorophenol red β-D-galactopyranoside，CPRG），黃色底物分解為紅色產物，其濃度可通過分光光度法進行測量。

Rikke Brix 等[10]評估了該重組酵母系統作為環境樣品的預篩選工具的適用性，將樣品連續稀釋后加入含有顯色底物和重組酵母細胞的培養基中，結果顯示樣品中的17β-雌二醇的檢測水平為0.681 ng/mL，檢測限為 0.084 ng/mL～0.73 ng/mL。Vieira Dias 等[11]使用該重組酵母檢測系統評估了巴西里約熱內盧天然水域和官渡河水樣中的雌激素活性物質，結果顯示在里約熱內盧河流的三個采樣地點采集的水樣的17β-雌二醇等價值（17β-estradiol equivalents，EEQ）最大濃度為16 ng/L，官渡河采集樣品中最大EEQ 值為15 ng/L。Beck 等[12]使用該重組酵母系統檢測了德國波羅的海沿海地區地表水的總雌激素活性物質含量，檢測結果顯示Inner Wismar Bay，Eggers Wiek 和達爾斯半島地區的 EEQ 值范圍分別為 0.06 ng/L～0.34 ng/L、0.03 ng/L～0.41 ng/L 和 0.17 ng/L～0.28 ng/L。

Hairong Xu 等[13]基于綠色熒光蛋白（yEGFP 基因）構建了一株可以快速篩選和監測環境中雌激素化學物質的重組酵母細胞，該菌株先后插入兩個質粒，包括一個含有與GPD 基因啟動子融合的人雌激素受體（hER）cDNA 質粒和另一個由 ERE 控制下插入yEGFP 基因（綠色熒光蛋白）的質粒，檢測樣品中雌激素活性化學物質的濃度可通過表達的綠色熒光蛋白的量來進行判定。Sylwia 等[14]根據此重組酵母表達系統檢測了從波蘭農村Leczna 和盧布林省工業區ZAPulawySA 的12 個農場收集的奶牛產奶樣品的雌激素含量，檢測結果顯示農村和工業區的牛奶樣品中檢測到含有雌激素活性的樣品分別占有43%、57%，其中農村地區樣品的雌激素EEQ 值范圍為0.30 ng/L～0.44 ng/L，工業地區樣品的雌激素EEQ 值為0.29 ng/L～0.49 ng/L。

Salste L 等[15]通過化學分析和基于熒光素酶（Luc基因）構建的重組酵母表達系統測定了從市政污水處理廠收集的廢水樣品中的17β-雌二醇、雌酮、雌三醇和17α-炔雌醇等雌激素和雌激素活性物質的含量，結果顯示雌激素的平均水平值為4 ng/L～7 ng/L。除了酵母表達系統，也有研究者基于其他的表達載體構建了雌激素檢測反應器。Christoph Zutz 等[16]通過基因工程技術構建了一株含有人類雌激素受體α 和β-半乳糖苷酶基因的修飾菌株構巣曲霉Aspergillus nidulans，使用血液、尿液、唾液和牛奶樣品對該真菌生物反應器的雌激素反應進行驗證，并將結果與酶聯反應法檢測結果進行比較，檢測結果基本顯示出一致性，此外，該生物反應器檢測樣品不需要提前進行預處理即可直接檢測，對于17β-雌二醇等雌激素檢測限低至1 ng/L。Thomas Hahn 等[17]通過基因工程構建了在Arxula adeninivorans 衍生的葡糖淀粉酶（glucoamylase，GAA）啟動子控制下表達人體雌激素受體（h ERα）和由雌激素感應元件（estrogen response element，ERE）控制表達克雷伯氏菌植酸酶（klebsiella phytase，PHYK）報告基因的重組Arxula adeninivorans 表達系統，在雌激素化合物的存在下表達系統誘導表達植酸酶，研究者探索了不同的啟動子位置插入不同數量的雌激素感應元件對報告基因表達的影響，在所有的重組細胞中，雌激素活性的檢測限先后達到了10 ng/L 和5 ng/L。

生物反應器檢測法是20 世紀90 年代才發展起來的雌激素研究方法，該方法除了前期構建表達系統需要一定的技術基礎，在檢測階段不僅費時少、靈敏度高、特異性強，在試驗操作和成本上也具有極大的優勢。

2 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）

高效液相色譜方法是20 世紀80 年代至90 年代發展的一門科學檢測技術，因其靈敏度高、檢測時間短、可同時進行定性和定量檢測而得到快速廣泛的應用，包括在科學研究中各種化學物質的研究與檢測。在雌激素活性物質檢測方面，高效液相色譜主要應用于牛奶、農產品等樣品的檢測。Yan 等[18]使用固相萃取-高效液相色譜技術，快速測定了從中國新鄉隨機采集的3 種不同品牌的牛奶樣品中的雌酮、雌二醇和雌三醇含量，這三種雌激素物質在牛奶樣品中的平均覆蓋率分別為92.6%、90.9%、104.1%，在牛奶樣品中的平均含量分別為 0.275、0.247、0.371 μg/mL，該液相檢測條件對3 種雌激素物質的檢測限分別為0.028、0.025、0.045 μg/mL。丁郭影等[19]以 HPLC 技術為基礎，結合微波輔助提取法，建立了牛奶中雌激素檢測的方法，在最佳的液相色譜條件及微波工藝條件下，研究結果得到雌二醇、雌三醇、雌酮的檢測限分別為：145、1.68、1.72 μg/mL。劉敏等[20]以家禽豬糞中較為常見具有潛在危害的17α-雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇和雌酮作為研究對象，建立了分析這4 種類固醇雌激素的GC-MS 檢測方法，檢測結果表明，在優化的檢測條件下，這四種雌激素的檢測限分別為 8.0、2.5、5.1、3.3 μg/kg，平均加標回收率在92.3%～137.4%之間。Xiuqin Wang等[21]使用高效液相色譜結合管內固相微萃取技術建立了一種簡便靈敏的檢測方法，分析了5 種雌激素標準樣品，具有良好的重復性，標準偏差＜4.1%，檢出限為0.05 mg/L～0.30 mg/L。Guihua Gao 等[22]基于幾種金屬-有機骨架混合基質膜的漩渦輔助膜萃取方法提取人體尿液中的4 種雌激素-雌酮、17β-雌二醇、雌三醇和炔雌醇，使用高效液相色譜技術熒光檢測進行分析，結果表明提取的雌激素檢測范圍為0.02 ng/mL～200 ng/mL，檢出限為0.05 ng/mL～1.0 ng/mL。雖然高效液相色譜具有很好的靈敏度和特異性，也廣泛應用于各個高校實驗室和研究所檢測，但存在儀器本身成本高、不易移動、檢測地點受局限等短板，這些都是無法解決也難以得到改善的因素。

3 氣相色譜法（gas chromatography，GC）

氣相色譜法是所有雌激素活性物質檢測方法中最早發展應用的方法，因其高效能、高靈敏度、強選擇性、極快的分析速度、操作簡便等優點，在20 世紀60年代至80 年代間，研究者們對各類樣品中雌激素活性物質的檢測主要就是通過氣相色譜法。目前，氣相色譜法在雌激素物質檢測方面主要是應用于自然界河流、工業區廢水樣品的檢測。Basheer 等[23]使用聚合物涂層空心纖維微量提取技術結合氣相色譜法檢測水庫及飲用水樣品中的雌激素含量，通過逐漸降低樣品中分析物濃度得出該檢測系統的檢測限范圍為0.03 ng/L～0.8 ng/L。Zhou 等[24]采用柱前三甲基甲硅烷基衍生化和氣相色譜結合方法檢測了地表水和廢水處理廠流出的處理水樣品中的雌激素含量，在優化的檢測條件下，與超純水空白相比，色譜中沒有明顯干擾出現，樣品中 DES、E1、E2、EE2、E3、Ev 的檢出限分別為 0.01、0.03、0.03、0.07、0.09、0.13 ng/mL。廖濤等[25]使用固相萃取-氣相色譜/質譜聯用法建立了有效檢測殘留雌激素的方法，對水中的雌酮、雌二醇、雌三醇、雙酚A、炔雌醇等9 種雌激素進行了同時檢測，初步分析了荊州市四湖總干渠受環境雌激素污染的3 個不同斷面的污染程度。Rocha 等[26]使用氣相色譜法分析了分別在4 個季節中從塔古斯河9 個地點中采集的水樣，評估了包括天然、工業、制藥、家庭污染物、植物甾醇等在內的17 種雌激素類似物，并從其中的兩個采樣地點中發現了來自工業和家庭污染的雌激素物質。近年來隨著高效液相和其他檢測方法的發展，氣相色譜檢測的應用逐漸減少，且其不足之處類似于高效液相色譜法，只能在室內進行樣品的檢測。

4 拉曼光譜法（Raman spectroscopy，RS）

拉曼光譜檢測技術[27]是利用拉曼光譜來研究分子振動、轉動的一種光譜學方法，其發展應用相比氣相色譜法和高效液相色譜起步更晚，在雌激素檢測方面的研究也是近十年才開始探索。因拉曼光譜主要功能為定性檢測，故在雌激素的檢測方面更多集中于樣品中多種雌激素物質的定性檢測。馮超等[28]應用RM-200型便攜式拉曼光譜儀對17β-雌二醇、雌三醇和乙烯雌酚等3 種激素類藥品進行拉曼光譜檢測分析，并對3種雌激素進行了分析對比和模擬計算。結果表明拉曼技術可以快速準確的定性檢測出這3 種雌激素，乙烯雌酚在 724、822、908、1 141、1 254、1 554、1 925 cm-1處存在特征峰；雌三醇在 831、1 045、1 111、1 278、1 417 cm-1處存在特征峰；17β-雌二醇 在 865、1 031、1 075、1 257、1 432 cm-1處存在特征峰，上述峰可作為拉曼光譜檢測3 種激素的依據。Yang Liu 等[29]建立了一種簡單、快速的表面增強共振拉曼散射（surface enhanced Resonance raman scattering，SERRS）的痕量酚類雌激素檢測方法，通過偶聯反應，偶氮化合物形成強烈的SERRS 活性，建立了雌酮、雌三醇、雙酚A 的定性檢測方法，因偶氮染料的每一個印記只會對特定的雌激素進行染色，故具有極高的特異性，適用于通過偶聯反應進行檢測的酚類雌激素。拉曼光譜法目前應用相比上述檢測方法并不廣泛，主要原因在于其在定量檢測方面的不足，拉曼光譜的定性檢測對商業食品中雌激素含量的定量檢測毫無應用之處，這在目前對食品安全的日益重視的大趨勢下是一個極大的不足。

5 其他檢測方法

5.1 化學發光法（chemiluminescence，CL）

化學發光分析法[30]是分子發光光譜分析法中的一類，因其操作簡便、具有較好的靈敏度而被應用于食品藥品分析、環境檢測等領域。謝良梟等[31]采用KMnO4-鄰菲咯啉釕-Na2SO3化學發光體系來測定雌激素含量，檢測結果表明其檢出限為3.8×10-7mg/mL，并使用該方法成功應用于實際樣品中雌激素的檢測。

5.2 電化學生物傳感器（electrochemical biosensor，EB）

生物傳感器技術是分析生物科學的一個分支，其中電化學生物傳感器是最早出現的生物傳感器，該方法利用了生物反應的特異性，同時具有電化學分析方法的高靈敏度，從而可以實現對生物大分子之間相互作用的實時檢測。Beitollahi H 等[32]應用一種以磁性分子印跡納米粒作為表面活性劑來改良電極的電化學傳感器檢測雌激素雙酚A，結果表明其對雙酚A 的檢測靈敏度是未經過改良的傳感器的2.6 倍，且該方法已證實應用于樣品的大量檢測。Zhu L 等[33]也使用該方法對飲用水和湖水中的雌激素進行了檢測，檢測范圍為6.0×10-7mol/L～1.0×10-4mol/L，檢出限為 1.0×10-7mol/L。

5.3 分子印跡技術（molecular Imprinting Technology，MIT）

分子印記技術[34]將模板分子與功能單體相結合，在交聯劑的作用下共聚得到固體介質，通過物理或化學方法將模板分子洗脫，獲得具有與目標分子空間構型和功能基團排列相匹配的結合位點的分子印跡聚合物。張淑瓊等[35]采用氧化鋁模板法和溶膠凝膠法，以雌酮作為印跡分子，合成了對雌酮有特異性識別的SiO2納米管膜，研究結果表明納米管對目標分子具有高選擇性、高親和性、高容量和快速結合能力。馬金余等[36]以己烯雌酚為模板分子，α-甲基丙烯酸為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯劑，合成己烯雌酚分子印跡聚合物，通過選擇不同濃度的甲醇水溶液，己烯雌酚達到理想的分離純化效果；對加標雞肉樣進行了含量測定，回收率可達95%以上。

5.4 酶聯免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

酶聯免疫法主要是根據抗原抗體的特異性結合對樣品中的雌激素物質進行檢測，在靈敏度檢測方面不夠高，但因具有較強的特異性，檢測時間短，故在樣品的定性檢測方面具有廣泛的應用。Wang 等[37]研究開發了針對雌（E-1）、17β-雌二醇（17β-E-2）和雌三醇（E-3）的高特異性、高靈敏性單克隆抗體，根據競爭性酶聯免疫吸附劑，抗 E-1、抗 17β-E-2 和抗 E-3 單克隆抗體的半數最大抑制濃度值分別為0.46、0.36、0.39 ng/mL。

6 結論與展望

目前已有大量文獻研究表明雌激素對女性生理現象混亂、男性生殖系統異常、動物繁殖能力及對機體神經系統、消化系統、呼吸系統、心血管系統和骨骼系統的常見疾病都有一定程度的影響，因此，建立更靈敏、更高效、更完整的雌激素檢測體系刻不容緩。當前關于雌激素的檢測研究主要集中在雌酮、雌二醇、雌三醇和炔雌醇等幾種物質，研究范圍相對狹隘，此外，除了已經發現但還未付諸檢測研究的雌激素活性物質，還有大量尚未被發現的帶有雌激素毒性的物質，需要我們進行進一步地探索發現，這對人類的生存環境和減少身體疾病具有重要意義。

在雌激素檢測方法研究方面，相對成熟的方法主要是氣相色譜和高效液相色譜法，筆者在探索霉菌毒素玉米赤霉烯酮的生物降解機理過程中，主要使用高效液相色譜法檢測ZEA 的含量，雖然檢測靈敏度和重現性均良好，但不適用現場、快速的檢測，尤其儀器維護成本較高[38-44]。本文詳細介紹的轉基因生物反應器在定性和定量檢測以及研究成本、生態環境方面都具有的明顯的優勢，但目前國內外關于該方法的建立研究屈指可數，且其表達載體主要為酵母，在日后的研究中，可以在目的基因、受體和載體當面作更為深入的研究，使轉基因生物反應器檢測方法發展為更成熟的檢測體系。