黃花倒水蓮多糖的純化、表征與體外抗氧化活性研究

張小梅，劉素蓮，張銳銳，林冰梅，王晶晶，林家遜，許有瑞

（桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 541004）

黃花倒水蓮（Polygala fallax Hemsl.）為遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志屬灌木或小喬木，又名假黃花遠(yuǎn)志、黃花參、倒吊黃、吊吊黃、念健、一身保暖、鴨仔兜等，生于山谷林下水旁蔭濕處，分布于江西、福建、湖南、廣東、廣西和云南[1]。其根入藥，性平，味甘、微苦，具有補(bǔ)氣血、健脾利濕、活血調(diào)經(jīng)之功效[2]，可用于治療病后體虛、腰膝酸痛、跌打損傷、急慢性肝炎，抗衰老等，為瑤、苗、壯等少數(shù)民族的常用藥物[3-4]，也被作為草藥中的“黨參”、“黃芪”來(lái)使用[5]。現(xiàn)代研究表明黃花倒水蓮含有多種化學(xué)成分，如皂苷、多糖、酚類、酮類、寡糖酯、有機(jī)酸等[6]。其中，多糖作為黃花倒水蓮的活性成分之一能夠提高機(jī)體的抗應(yīng)激能力[5]，也能提高正常小鼠的非特異性免疫和特異性免疫[7]，此外黃花倒水蓮多糖（polysaccharide of Polygala fallax Hemsl.，PFP）還對(duì)四氯化碳致急性肝損傷的小鼠有保護(hù)作用[8]。

基于此，本研究參照前期優(yōu)選的提取工藝，對(duì)PFPs 進(jìn)行提取、分離、純化與表征，并評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，以期為今后對(duì)PFPs 進(jìn)行更深入的研究與開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃花倒水蓮根：桂林市六合路中藥材市場(chǎng)；無(wú)水乙醇、95%乙醇、三氯甲烷、正丁醇、苯酚、濃硫酸、維生素C（VC）：西隴化工股份有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3- methyl-5-pyrazalone，PMP）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯(lián)氮-2（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽 [2，2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：Sigma 公司；葡萄糖（Glc）、鼠李糖（Rha）、甘露糖（Man）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；葡聚糖凝膠G-75：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

BT224S 精密分析電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；CTFD-12S 冷凍干燥機(jī)：青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；80-2B 低速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；HC-3618R 高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛朗儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵、DLSB-10/20 低溫冷卻循環(huán)泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；BV1005-E 漩渦混合器：上海柯淮儀器有限公司；A210049 傅立葉變換紅外線光譜儀：島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；LC-20A 高效液相色譜儀：日本島津儀器公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃花倒水蓮多糖的提取

稱取一定量低溫干燥的黃花倒水蓮粉末（14 目），無(wú)水乙醇回流脫脂3 次（2 h/次），過濾，藥渣揮去乙醇。以30 倍量蒸餾水，82 ℃水浴提取2.4 h（重復(fù)提取3次），過濾，合并濾液并減壓濃縮，在濃縮液中加入無(wú)水乙醇至醇濃度為90%，于4 ℃的冰箱內(nèi)靜置過夜。取沉淀，經(jīng)Sevag 法除蛋白，活性炭脫色，冷凍干燥后得到黃花倒水蓮多糖。

1.2.2 黃花倒水蓮多糖的純化

稱取10 g 葡聚糖凝膠G-75 于蒸餾水中加熱溶脹，裝柱（直徑2 cm），用蒸餾水平衡后，稱取黃花倒水蓮多糖0.05 g，溶于1 mL 蒸餾水中，上樣，經(jīng)蒸餾水洗脫（0.3 mL/min），用具塞試管收集洗脫液（2 mL/管），取其中0.2 mL 用苯酚-濃硫酸法檢測(cè)多糖，繪制黃花倒水蓮多糖的洗脫曲線。依照洗脫曲線合并洗脫液，冷凍干燥后得到不同分子量的多糖組分。

1.2.3 分子量測(cè)定

多糖組分的分子量及其分布由凝膠滲透色譜法測(cè)定（gel permeation chromatography，GPC）。GPC 色譜條件：LC20 泵，RID-20 示差折光檢測(cè)器，TSKgel GMPWXL 色譜柱（7.8 mm×300 mm，13 μm），流動(dòng)相為0.06% NaN3水溶液，流速為 0.6 mL/min，柱溫為 35 ℃，窄分布的葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)物。

1.2.4 紅外光譜（infrared spectrum，IR）測(cè)定

取黃花倒水蓮多糖組分適量，同KBr 混合研磨均勻，壓片后進(jìn)行紅外光譜分析，掃描范圍為400 cm-1～4 000 cm-1。

1.2.5 PFP1的單糖組成分析

1.2.5.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.5.2 PFP1的水解

稱取10 mg PFP1置于具塞試管中，加入濃度為3 mol/L 的TFA 1 mL，密封，搖勻后置于105 ℃油浴中水解4 h。反應(yīng)結(jié)束后加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值為中性，1 000 r/min 離心10 min，取上清液待用。

1.2.5.3 單糖標(biāo)準(zhǔn)品及PFP1水解產(chǎn)物的PMP 衍生化

分別移取各單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和PFP1水解產(chǎn)物0.5 mL，置于具塞試管中，依次加入0.3 mol/L 氫氧化鈉0.5 mL，0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液0.5 mL，渦旋混勻后于70 ℃水浴加熱反應(yīng)1.5 h。反應(yīng)結(jié)束后取出試管冷至25 ℃，加入0.3 mol/mL 鹽酸溶液0.5 mL 中和，渦旋混勻后，加入氯仿萃取，渦旋振蕩2 min，4 500 r/min 離心10 min，取上清液重復(fù)用氯仿萃取2 次[9]。將萃取完的上清液過0.45 μm 濾膜，待高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）進(jìn)樣測(cè)定。

1.2.5.4 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.05 mol/mL 磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）-乙腈（78∶22，體積比），流速為 1.0 mL/min，柱溫 35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm，進(jìn)樣體積20 μL。

1.2.6 PFP1體外抗氧化活性

1.2.6.1 DPPH 自由基清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]，在試管中依次加入3 mL 不同濃度的黃花倒水蓮多糖溶液與新鮮配制的1 mL 0.1 mmol/L DPPH 無(wú)水乙醇溶液，搖勻，在25 ℃暗處放置30 min后，于517 nm 處測(cè)定其吸光度。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，按下式計(jì)算DPPH 自由基清除率：

清除率/%=[1-（Ai-A）j/Ao]×100

式中：Ai為加入多糖溶液或VC時(shí)的吸收值；Aj為只加樣品時(shí)的背景吸收值；Ao為蒸餾水代替樣品溶液時(shí)的吸收值。

1.2.6.2 羥基自由基清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11]，在試管中依次加入2 mL 1.8 mmol/L FeSO4溶液，1.5 mL 1.8 mmol/L 水楊酸乙醇溶液，1 mL不同濃度黃花倒水蓮多糖溶液，1 mL 0.3%H2O2溶液，搖勻，在25 ℃放置30 min 后于520 nm 處測(cè)定其吸光度。以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照，按下式計(jì)算羥基自由基清除率：

清除率/%=[1-（Ai-A）j/Ao]×100

式中：Ai為加入多糖溶液或VC時(shí)的吸收值；Aj為只加樣品時(shí)的背景吸收值；Ao為蒸餾水代替樣品溶液時(shí)的吸收值。

1.2.6.3 超氧陰離子清除率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[12]，在試管中依次加入0.5 mL 不同濃度的黃花倒水蓮多糖溶液，5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液，在25 ℃放置10 min 后加入0.2 mL 6 mmol/L鄰苯三酚，迅速搖勻，立即在315 nm 處每30 s 測(cè)定1次吸光度，共測(cè)4 min。計(jì)算樣品吸光度值隨時(shí)間的變化率，以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照，按下式計(jì)算超氧陰離子自由基清除率：

清除率/%=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100

式中：Ai為加入多糖溶液或VC時(shí)的吸收值；Aj為只加樣品時(shí)的背景吸收值；Ao為蒸餾水代替樣品溶液時(shí)的吸收值。

1.2.6.4 ABTS+自由基清除率的測(cè)定

參考文獻(xiàn) [13]，分別配制7 mmol/LABTS 溶液與2.45 mmol/L K2S2O8溶液，然后按 1∶1 體積比混合定容至25 mL，25 ℃避光反應(yīng)15 h，加蒸餾水稀釋54.7 倍至其在 734 nm 處吸光度為 0.70±0.02 后，30 ℃保溫備用。移取該溶液0.2 mL 至試管中，再加入5 mL 不同濃度黃花倒水蓮多糖溶液，充分混合，避光25 ℃反應(yīng)6 min后，于734 nm 處測(cè)量吸光度，以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照，按下式計(jì)算ABTS+自由基清除率：

清除率/%=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100

式中：Ai為加入多糖溶液或VC時(shí)的吸收值；Aj為只加樣品時(shí)的背景吸收值；Ao為蒸餾水代替樣品溶液時(shí)的吸收值。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花倒水蓮多糖的分離純化

黃花倒水蓮多糖經(jīng)G-75 葡聚糖凝膠柱洗脫分離后的曲線如圖1。

圖1 黃花倒水蓮多糖的洗脫曲線Fig.1 Elution curve of refined PFP on Sephadex G-75 chromatography column

如圖1，得到PFP1和PFP2兩個(gè)組分。然而，相對(duì)于PFP1來(lái)說(shuō)，PFP2的質(zhì)量極少，因此本研究只對(duì) PFP1進(jìn)行了表征和體外抗氧化活性測(cè)定。

2.2 分子量及其分布的測(cè)定

GPC 分析結(jié)果見圖2。

由圖2可知，可知PFP1的分子量為20 794 Da，多分散指數(shù)為1.32，表明經(jīng)葡聚糖G-75 凝膠柱層析后分離得到的PFP1具有很高的純度。

2.3 IR分析

PFP1的IR 見圖3，其中具有典型的多糖吸收特征峰，包括3 369 cm-1處強(qiáng)而寬的O-H 伸縮振動(dòng)峰，1 635 cm-1處較強(qiáng)的C-O 伸縮振動(dòng)峰和1 413 cm-1C-H變角振動(dòng)峰。

圖2 PFP1的GPC色譜圖Fig.2 GPC chromatogram of PFP1

圖3 PFP1的IR圖Fig.3 IR spectrum of PFP1

2.4 PFP1的單糖組成分析

2.4.1 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖和PFP1水解產(chǎn)物PMP 衍生物的分離

混合標(biāo)準(zhǔn)單糖和PFP1水解產(chǎn)物PMP 衍生物的HPLC 色譜圖見圖4。

由圖4可知，6 種標(biāo)準(zhǔn)單糖以及PFP1水解后經(jīng)PMP 衍生化后的產(chǎn)物有著很好的分離效果。經(jīng)比較保留時(shí)間得出PFP1主要是由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成。但是由于選取的標(biāo)準(zhǔn)單糖數(shù)量有限，仍有一種單糖種類未被確認(rèn)。

2.4.2 PFP1的單糖組成

將標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液制成一系列不同濃度的對(duì)照品溶液，按1.2.5 的步驟進(jìn)行單糖衍生及色譜分析。以對(duì)照品溶液的濃度作為Y，相應(yīng)的峰面積作為X 進(jìn)行擬合，得到各單糖的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，見表1。由PFP1中各單糖的峰面積，計(jì)算得PFP1的單糖組成摩爾比為：0.09∶1∶0.48∶0.64∶0.71∶0.35。

圖4 PMP 衍生物的HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of derivatives of PMP

表1 各單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Monosaccharide standard curve

2.5 PFP1體外抗氧化活性

PFP1分別對(duì)DPPH 自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基和ABTS+自由基的清除率結(jié)果見圖5。

圖5 PFP1 對(duì)各自由基的清除率（n=3）Fig.5 Clearance of free radicals by PFP1

由圖5可知，PFP1對(duì)DPPH 自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基和ABTS+自由基均具有一定的清除能力，且呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系，但其清除能力與陽(yáng)性對(duì)照VC相比則較弱。當(dāng)濃度為5 mg/L 時(shí)，PFP1對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到最大值81%，而VC在濃度為1 mg/L 時(shí)就達(dá)到最大清除率92%。對(duì)于羥基自由基，PFP1在濃度為7.5 mg/L 時(shí)，清除率達(dá)到最大值94.3%，而VC在濃度為0.5 mg/L 時(shí)就達(dá)到最大清除率98.5 %。對(duì)于超氧陰離子自由基，PFP1在濃度為15 mg/L 時(shí)，清除率達(dá)到最大值100.3%，而VC在濃度為5 mg/L 時(shí)達(dá)到最大清除率98.2 %。對(duì)于ABTS+自由基，PFP1的清除率達(dá)到最大值99.6 %時(shí)的濃度為2.5 mg/L，而VC達(dá)到最大清除率99.8%時(shí)的濃度則為0.25 mg/L。

3 結(jié)論

本研究通過水提醇沉法獲得PFP，經(jīng)Sevag 法脫蛋白、活性炭脫色以及葡聚糖凝膠-G75 柱分離純化獲得2 種PFP 組分，分別用IR、GPC 與柱前衍生PMPHPLC 法對(duì)量大的PFP1組分進(jìn)行表征分析。結(jié)果顯示其IR 光譜中呈現(xiàn)多糖的典型特征吸收峰，分子量為20 794 Da，多分散指數(shù)為1.32。而且PFP1是由甘露糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖與一種未知單糖組成的一種雜多糖，摩爾比為0.09∶1∶0.48∶0.64∶0.71∶0.35。此外 PFP1對(duì) 4 種自由基均有清除能力，且在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。本研究為PFP 進(jìn)行更深入的抗衰老方面的研究與開發(fā)利用提供理論依據(jù)。