乳酸菌L-SZ303發酵產γ-氨基丁酸條件的優化

王冰聰，吳瓊，遲燕平

（1.長春大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130022；2.吉林省農業科學院農產品加工所，吉林 長春 130124）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），又稱4-氨基丁酸、氨酪酸，是一種非蛋白質組成的天然氨基酸，分布非常廣泛[1]，是哺乳動物中樞神經系統中重要的抑制性神經遞質[2]，具有很多重要的生理功能，如控制高血壓[3]，治療癲癇病，延緩衰老，增進腦活力[4]，安定神經[5]，改善一系列保健和生理功能，如更年期綜合癥[6]。如今GABA 已經發展成為一種新型的功能性因子[7]，被大量的利用在農業、林業、工業等領域中[8-10]。制備GABA 的方法主要包括化學合成和生物合成兩大類。化學合成法反應速率快，但副產物較多，成本高，安全性低[11]。生物合成法是基于L-谷氨酸及其鈉鹽或富含谷氨酸的物質，并且通過利用食品安全級的微生物如乳酸菌、曲霉菌和酵母菌等的發酵來生產[12]，其產品具有產量高，成本低，安全性高的優點。

在本研究中，以在前期工作中篩選得到一株高產GABA 的乳酸菌L-SZ303 為研究對象，通過單因素試驗和響應面法對其產GABA 的發酵工藝條件進行優化，從而提高GABA 產量。用米糠作為發酵培養基的氮源，為規模化利用廉價農副產品生產食品奠定基礎，對于GABA 的發酵生產具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與儀器

乳酸菌菌株：農產品加工所實驗室保藏乳酸菌菌株L-SZ303。儲存條件為，在瓊脂斜面保藏培養基上傳代，保存于4 ℃冰箱，每兩周轉接一次[13]。

GABA 標樣（≥99.9%）：Sigma 公司；L-谷氨酸鈉：中國醫藥集團；米糠：農村飼料；其他試劑均為國產分析純。

T-6vm 型分光光度計：南京菲勒儀器有限公司；HZQ-QX 全溫振蕩器：哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；3K15 高速離心機：Sigma 公司。

1.2 培養基

菌株斜面保藏培養基：酪蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖5 g/L、乙酸鈉5 g/L、吐溫-80 10 mL、檸檬酸銨2 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳 0.05 g/L，瓊脂 15 g/L，pH 6.6～6.8[14-15]。

發酵培養基（TYG 培養基）：胰蛋白胨5 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖10 g/L、丁二酸鈉5 g/L、L-谷氨酸鈉10 g/L，pH 6.6～6.8[16]。

1.3 方法

1.3.1 發酵培養

將菌株L-SZ303 接入MRS 液體培養基中，放入35 ℃的培養箱中進行搖培16 h，然后按2%（體積分數）的接種量接入TYG 液體培養基中進行發酵試驗，35 ℃搖培發酵72 h。

1.3.2 定性定量分析

發酵液中GABA 定性：薄層層析法，展開劑組成為正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶3（體積比），0.4%的茚三酮作為顯色劑加入展開劑中，分別配制GABA 標準品和L-谷氨酸鈉1 g/L 用于定性參比，距離層析板底1 cm 點樣2 μL（直徑不超過4 mm），于層析缸中展開，然后于90 ℃下顯色10 min[17]。

發酵液中GABA 定量：Berthelot 比色法，在0.5 mL離心稀釋40 倍后的發酵液中加入0.2 mL 0.2 mol/L 硼酸鹽緩沖液（pH9.0），1 mL 6%苯酚和0.4 mL 9%次氯酸鈉。劇烈振蕩后，將混合物置于沸水中10 min，然后置于冰浴中20 min，并繼續振蕩直至出現藍色。最后，向混合物中加入2 mL 60%乙醇，并在645 nm 波長下測定其光密度值（OD645 nm）[18]。

1.3.3 正交試驗優化培養基

在對乳酸菌L-SZ303 發酵特性的初步了解基礎上，安排六因素三水平正交試驗L27（36）研究葡萄糖、胰蛋白胨、丁二酸鈉、酵母粉、米糠、L-谷氨酸鈉對發酵產GABA 的影響，確定最佳的培養基配方。

1.3.4 優化培養條件

1.3.4.1 響應面法優化培養條件

以初始pH 值，發酵溫度以及發酵時間3 個因素為自變量，以GABA 為響應值，進行響應面試驗設計，確定最優的發酵條件。

1.3.4.2 模型驗證

通過響應面法優化乳酸菌L-SZ303 產GABA 發酵培養條件進行發酵試驗，比較模型預測值和試驗值，驗證模型的有效性。

1.3.4.3 數據分析

采用Design Expert 7.0 軟件設計三因素三水平響應面分析試驗，試驗結果采用Design Expert 7.0 軟件進行數據處理和分析，確定最佳培養條件。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基的確定

在單因素試驗的基礎上，將GABA 發酵培養基的6 種成分：葡萄糖、胰蛋白胨、丁二酸鈉、酵母粉、米糠、L-谷氨酸鈉，分別作為正交試驗的6 個因素，安排三水平正交試驗L2（736），因素和水平設計見表1，正交試驗結果見表2，方差分析見表3。

表1 正交設計的因素和水平取值表Table 1 Orthogonal design factors and level values

表2 正交試驗結果表Table 2 Orthogonal design results table

續表2 正交試驗結果表Continue table 2 Orthogonal design results table

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

由方差分析可知，葡萄糖、胰蛋白胨、米糠、酵母粉、L-谷氨酸鈉均極顯著。由表2可知，6 個因素對發酵液中GABA 含量的影響大小依次為葡萄糖＞胰蛋白胨＞米糠＞酵母粉＞L-谷氨酸鈉＞丁二酸鈉，即培養基中葡萄糖和胰蛋白胨對GABA 的生成影響較為顯著，米糠次之，酵母粉，L-谷氨酸鈉和丁二酸鈉的影響程度相差不大。由表2可知6 個因素的最佳組合為A3B3C2D3E3F3，由于最佳條件不在這27 次試驗中，所以做3 次驗證試驗A3B3C2D3E3F3取均值后得到GABA的含量為11.367 g/L，與最好的8 號試驗進行比較高于8號試驗，由此得最佳的培養基組成配方為：葡萄糖15 g/L，胰蛋白胨25 g/L，丁二酸鈉2 g/L，酵母粉6 g/L，米糠6 g/L，L-谷氨酸鈉5 g/L。

2.2 培養條件的確定

根據Box-Behnken 的中心組合設計原理，設計了三因素三水平的響應面分析（response surface methodology，RSM）試驗，共有17 個試驗點，以培養基初始pH值、發酵溫度、發酵時間3 個因素為自變量，以GABA含量為響應值，試驗因素與水平的選取見表4。

表4 響應面分析的因素和水平取值表Table 4 Factors and levels of response surface analysis

17 組試驗可分為兩類：1～12 是析因試驗，13～17是中心試驗，用以估計試驗誤差，響應面分析試驗安排及每次試驗得到的GABA 的含量（g/L）見表5，回歸分析見表6。

表5 Box-Behnken 試驗設計及響應值Table 5 Box-Behnken test design and response values

表6 方差分析表Table 6 Analysis of variance

根據試驗結果，通過響應面分析軟件分析數據，以GABA 產量為響應值，得到回歸方程表達為：Y=13.38+0.086X1+0.18X2+0.1X3-0.11X1X2-0.031X1X3-4.0×10-3X2X3-0.25X12-0.91X22-0.21X32。

由方差分析得出P 值，模型極顯著，模型的失擬性不顯著，回歸決定系數R2=0.985 2，修正決定系數R2Adj=0.966 2，說明方程具有良好的擬合性，可以應用于對發酵條件優化的分析預測。根據結果進行分析：一次項 X1、X2、X3顯著。由表6可知，影響 GABA 產量的因素由大到小排序依次是發酵溫度、發酵時間、初始pH 值。發酵條件交互因素響應面立體分析見圖1。

數據分析表明回歸模型存在最大值，最佳發酵條件為：初始pH6.83、發酵溫度36.27 ℃、發酵時間3.23 d，此條件下理論預測最大值為13.403 4 g/L。由于實際情況，取發酵條件為：初始pH6.8、發酵溫度36 ℃、發酵時間3 d 進行3 次驗證試驗取平均值得GABA 產量為13.375 g/L，基本與預測值一致。

圖1 發酵條件交互因素響應面圖Fig.1 Fermentation condition interaction factor response surface diagram

3 結論

通過正交試驗和響應面的試驗設計，以GABA 產量為指標，采用比色法對發酵中GABA 含量進行測定，優化了乳酸菌L-SZ303 產GABA 發酵培養基及其發酵條件。確定了乳酸菌L-SZ303 產GABA 的最佳培養基配方：葡萄糖15 g/L，胰蛋白胨25 g/L，丁二酸鈉2 g/L，酵母粉 6 g/L，米糠 6 g/L，L-谷氨酸鈉 5 g/L。最適發酵條件：初始pH6.8、發酵溫度36 ℃、發酵時間3 d。試驗結果有良好的重現性，GABA 產量達13.375 g/L。