NET-1在結(jié)腸癌中的表達(dá)、臨床意義和預(yù)后分析

楊永江，武雪亮，屈 明，李曙光，薛 軍

據(jù)最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，2014年我國(guó)居民結(jié)直腸癌發(fā)病例數(shù)繼肺癌、胃癌之后位居第三，死亡例數(shù)繼肺癌、肝癌、胃癌、食管癌之后位居第五，嚴(yán)重威脅國(guó)民健康安全。在經(jīng)濟(jì)發(fā)展迅速的今天，該病在我國(guó)的發(fā)病率反而呈上升趨勢(shì)，并且近來有年輕化的趨勢(shì)[1-2]。新四極體-1(new EST tetraspan numbered 1,NET-1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種致癌基因，與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)、遷移和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究[3-5]證實(shí)，NET-1在子宮內(nèi)膜癌、肺癌、胃癌等諸多惡性腫瘤中均呈高表達(dá)狀態(tài)，而在結(jié)腸癌中的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。該研究應(yīng)用RT-PCR、Western blot、免疫組化法(immuno-histochemical staining，SP)，從基因、蛋白水平分析NET-1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況及與相關(guān)臨床病理特征的關(guān)系，為結(jié)腸癌的早期診斷、治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)提供可靠的分子生物學(xué)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2012年1月～2013年10月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院胃腸腫瘤外科手術(shù)切除的原發(fā)性結(jié)腸癌和癌旁正常組織標(biāo)本各50例，材料來自于病理標(biāo)本被證實(shí)的癌灶中心的癌細(xì)胞組織，另取標(biāo)本殘端切緣經(jīng)病理證實(shí)為正常結(jié)腸組織，所有病例均為原發(fā)腫瘤，且術(shù)前未行新輔助放化療等治療。

1.2 主要試劑與實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1主要試劑 兔抗人濃縮型NET-1單克隆抗體、免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉公司，RM-2245組織切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)LEICA公司，Odyssey雙色紅外熒光成像儀購(gòu)自德國(guó)LI-COR公司。TRIzol裂解液購(gòu)自南京KeyGentrans公司，DEPC水購(gòu)自美國(guó)sima公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自加拿大Fermentas，引物及產(chǎn)物測(cè)序購(gòu)自長(zhǎng)沙達(dá)爾鋒生物科技有限公司， 熒光定量PCR儀購(gòu)自鄭州南北儀器設(shè)備有限公司。

1.2.2RT-PCR法 提取總RNA濃度，設(shè)計(jì)NET-1上游引物：5′-CTCTCCAGCCCAGTCTCACA-3′下游引物：5′-CCCTCACACTCTTCGTGCAG-3′；Beta-Actin上游引物：5′-GTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′，下游引物：5′-CTGTCACCTTCACCGTTCCA-3′；反應(yīng)體系：1×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，cDNA模板2 μl，Taq酶1.25 U，上下游引物各1 μl，RNA 酶抑制劑1 μl，反應(yīng)總體積25 μl。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠后電泳分離，紫外線燈下觀察。

1.2.3Western blot法 提取50 mg蛋白，置入5×緩沖液(4 ∶1)，電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加5%脫脂奶粉封閉，滴加特異性的一抗，-4 ℃孵育過夜，加TBST洗滌液，滴加特異性二抗，37 ℃孵育1 h，再次加入TBST洗滌液，熒光成像檢測(cè)定量分析，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4SP法 10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm，蘇木精-伊紅染色，病理診斷。80 ℃烤箱烘烤30 min，脫水，內(nèi)源性過氧化物酶滅活，高溫高壓水化修復(fù)；加入一抗(1 ∶100)50 μl，4 ℃一夜；加入二抗50 μl，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水(70%～90%～100%)，松節(jié)油透明和樹膠行封片處理，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，光鏡下觀察。

1.2.5結(jié)果判定 按染色強(qiáng)度：無著色為0分，淡黃為1分，深黃2分，棕褐或棕黃3分；陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為 4分。兩者相加<2分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中等強(qiáng)度陽性()，6～7分為強(qiáng)陽性()，由兩名具備高級(jí)職稱的病理醫(yī)師經(jīng)雙盲法獨(dú)立評(píng)分。

1.2.6隨訪 定期復(fù)查、電話隨訪，末次隨訪時(shí)間為2017年12月31日，中位隨訪時(shí)間為50個(gè)月。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)NET-1mRNA的表達(dá)以NET-1/Beta-Actin比值作為RT-PCR定量分析，癌組織中NET-1mRNA的表達(dá)水平(0.95±0.07)，結(jié)直腸正常組織為(0.26±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.890，P=0.005)，見圖1。

2.2 Western blot檢測(cè)NET-1蛋白的表達(dá)以NET-1/Beta-Actin比值作為NET-1相對(duì)表達(dá)量，癌組織和正常組織中NET-1蛋白的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.010，P=0.003)，見圖2。

圖1 RT-RCR檢測(cè)NET-1在癌和癌旁正常組織中的表達(dá)

圖2 Western blot檢測(cè)NET-1在癌和癌旁正常組織中的表達(dá)

2.3 SP檢測(cè)NET-1蛋白的表達(dá)結(jié)腸癌組織中NET-1的陽性表達(dá)率為64.00%(32/50)明顯高于在正常組織中的表達(dá)36.00%(18/50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.392，P<0.001)，見圖3。

2.4 NET-1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系NET-1的表達(dá)與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)等相關(guān)，P均<0.05。分期越高、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和脈管浸潤(rùn)的患者NET-1的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，見表1。

表1 結(jié)腸癌組織中NET-1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖3 癌旁正常組織和癌組織中NET-1的表達(dá) SP×100

2.5 生存分析NET-1陽性組的中位生存時(shí)間為299 d(95%CI：230.07～303.93)，陰性組的中位生存時(shí)間為387 d(95%CI：279.16～335.82)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)，生存曲線如圖4。

2.6 Cox回歸分析Cox回歸模型分析顯示，NET-1表達(dá)水平(P=0.002)、脈管浸潤(rùn)(P=0.001)、是否存在轉(zhuǎn)移(P<0.001)和TNM分期(P<0.001)均是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，見表2。

表2 結(jié)腸癌患者預(yù)后Cox多因素回歸分析

3 討論

NET-1基因是研究較熱的一種致癌基因，系四聚體超家族(tetramer superfamily,TM4SF)的成員之一。NET-1基因定位于人染色體1p34.1，其mRNA全長(zhǎng)為1 297 bp，編碼蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)為128～853 bp，內(nèi)含241個(gè)氨基酸的開放閱讀框，具有典型的TM4SF結(jié)構(gòu)特征[6]。NET-1基因表達(dá)廣泛，幾乎表達(dá)于人類所有組織及相應(yīng)腫瘤細(xì)胞，通過與跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域的半胱氨酸殘基特異性結(jié)合，從而介導(dǎo)信號(hào)向胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的各個(gè)環(huán)節(jié)[7]。

圖4 結(jié)腸癌患者NET-1表達(dá)水平與生存期相關(guān)性

NET-1的發(fā)現(xiàn)主要是在基因芯片技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上開始被揭示的，隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展，在之后的研究中發(fā)現(xiàn)，NET-1、復(fù)制因子C亞單位2等因子在鼻咽癌組織中檢測(cè)到相對(duì)于正常組織中較高的表達(dá)水平，差異明顯。并且在重復(fù)測(cè)量后也得到相同的結(jié)果，提示NET-1的表達(dá)可作為鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)標(biāo)志物[8-9]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)水平與皮膚鱗癌的病理分型之間存在關(guān)聯(lián)，在一級(jí)和三級(jí)中的表達(dá)存在明顯差異，因而證實(shí)NET-1的表達(dá)水平與皮膚鱗癌的惡性程度、浸潤(rùn)和侵襲能力呈一定正相關(guān)[10]。

目前，對(duì)于NET-1在肝細(xì)胞癌和子宮內(nèi)膜癌中的研究較多，Wang et al[11]研究證實(shí)NET-l通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)使p27蛋白發(fā)生泛素化、磷酸化、降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，同時(shí)將多種細(xì)胞外信號(hào)逐級(jí)傳遞至細(xì)胞核，促進(jìn)細(xì)胞增殖和浸潤(rùn)。Wu et al[12]在鏡下發(fā)現(xiàn)NET-1在彌漫浸潤(rùn)的癌細(xì)胞及脈管癌栓內(nèi)呈高表達(dá)，其水平與癌細(xì)胞的病理分級(jí)、臨床分期和死亡風(fēng)險(xiǎn)呈正顯著相關(guān)，因而推測(cè)NET-1是影響肝細(xì)胞癌預(yù)后的獨(dú)立因素。宋曉花 等[13]通過對(duì)正常子宮內(nèi)膜、增生及子宮內(nèi)膜癌組織性免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NET-1在癌組織中的表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜和良性增生組織，且NET-1的表達(dá)與病變的病理分級(jí)、病變分期及轉(zhuǎn)移程度等均明顯相關(guān)，提示NET-1是子宮內(nèi)膜癌早期診斷、預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)。

本項(xiàng)研究從基因和蛋白兩方面均證實(shí)，NET-1mRNA和蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)均明顯高于癌旁正常組織，表明NET-1的異常表達(dá)能促進(jìn)結(jié)腸癌變的發(fā)生和發(fā)展，且NET-1表達(dá)越高，其對(duì)周圍組織器官的侵襲能力越強(qiáng)，肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)越大，TNM分期越晚；進(jìn)一步研究顯示NET-1與結(jié)腸癌患者的生存期相關(guān)，NET-1表達(dá)越高，其生存期越短，預(yù)后越差，NET-1的表達(dá)是結(jié)腸癌患者預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素。因而，NET-1檢測(cè)可作為結(jié)腸癌患者預(yù)后的重要生物學(xué)指標(biāo)。

綜上，NET-1的異常表達(dá)參與了結(jié)腸癌的發(fā)生和進(jìn)展過程，且與結(jié)腸癌患者的預(yù)后相關(guān)，但目前對(duì)其具體的致癌機(jī)制及相關(guān)通路的研究尚不明確，這也將是本課題下一步的研究方向。