HOXB7基因敲減對裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的抑癌機(jī)制研究

王 藝，趙雪峰

結(jié)直腸癌被確診后肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率約占1/4，而經(jīng)受根治術(shù)后肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率也約占1/4～1/2，且肝轉(zhuǎn)移為結(jié)直腸癌死亡率增高的主要原因[1]。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的逐步修訂或抗腫瘤藥物的特異性篩選之需求，選擇恰當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ椭陵P(guān)重要[2]。但更加迫切的任務(wù)是，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的專有腫瘤分子標(biāo)記物研發(fā)、想方設(shè)法提前發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移跡象、轉(zhuǎn)移線路的盡早阻斷。近期研究證實(shí)，HOXB7基因在諸多惡性腫瘤中主要調(diào)控腫瘤血管生成或早期轉(zhuǎn)移，但其在結(jié)直腸癌和/或肝轉(zhuǎn)移的研究寥寥無幾[3-4]。該研究將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HOXB7敲減或pcDNA3.1-scramble重組質(zhì)粒的人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29經(jīng)裸鼠脾臟接種建立穩(wěn)定的肝轉(zhuǎn)移模型后，觀察研究HOXB7基因敲減對裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的抑癌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和材料體質(zhì)量18～20 g，7周齡雄性，BALb/c品系20只實(shí)驗(yàn)裸鼠購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HOXB7敲減或pcDNA3.1-scramble重組質(zhì)粒的人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29由大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心構(gòu)建并提供。人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29、細(xì)胞培養(yǎng)試劑及組織染色試劑由大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心購入并提供。本研究由經(jīng)大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞混懸液制備 將已被轉(zhuǎn)染的人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29在37 ℃、5% CO2，含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液內(nèi)傳代培養(yǎng)，每2～3 d洗換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)細(xì)胞融合達(dá)80%～90%，采用胰酶消化后，1 000 r/min離心3 min，棄上清液，將細(xì)胞加入無小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌3次，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，用無小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2×107/ml，共備2 ml。將已制備的細(xì)胞混懸液在冰浴中保存，備30 min之內(nèi)完成接種。

1.2.2模型設(shè)計(jì) 制模前1周為實(shí)驗(yàn)裸鼠安定期，需對實(shí)驗(yàn)裸鼠禁止進(jìn)行一切刺激性操作。參與模型的實(shí)驗(yàn)裸鼠共20只，其中10只HOXB7基因敲減鼠列為研究組，而10只scramble鼠列為對照組。制模后實(shí)驗(yàn)裸鼠觀察周期為4周。見圖1。

圖1 模型設(shè)計(jì)

1.2.3建立顯微鏡輔助下結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型和制定結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移評分標(biāo)準(zhǔn) 選用地氟醚進(jìn)行裸鼠全身麻醉。制模全程采用SMZ-B2/T2體視顯微鏡完成操作。首先，取上腹正中5 mm小切口進(jìn)入腹腔，利用無損傷鑷子輕柔牽出網(wǎng)膜并顯露脾臟至腹外。隨后，采用31號注射器經(jīng)脾臟被膜進(jìn)針至脾實(shí)質(zhì)內(nèi)約2 mm，緩慢注入已被轉(zhuǎn)染的人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29混懸液100 μl (細(xì)胞數(shù)為2×106)，確認(rèn)注射部位脾臟顏色變白、腫脹及無滲漏，采用止血紗布外加濕紗布覆蓋注射部位5 min。最后，掀開濕紗布見脾臟無出血后離斷脾臟血管、移除脾臟，將網(wǎng)膜及周圍組織送入腹腔，逐層關(guān)腹，術(shù)畢。結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移評分參照本研究組制定的肝轉(zhuǎn)移評分標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.2.4解剖裸鼠和觀察指標(biāo) 每天常觀察、記錄實(shí)驗(yàn)裸鼠的一般狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)裸鼠觀察期滿予以處死。處死后立即解剖觀察腹腔內(nèi)血性腹水、淋巴結(jié)腫大、腹膜種植及肝轉(zhuǎn)移瘤形成情況；具體記錄實(shí)驗(yàn)裸鼠的肝轉(zhuǎn)移瘤大小、肝體質(zhì)量、病灶間融合、肝表面隆凸及肝轉(zhuǎn)移評分。完整移除的肝臟利用4%多聚甲醛充分固定，肝轉(zhuǎn)移瘤最大直徑為中心切開并制作組織蠟塊，4 μm厚度切片后進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞情況；具體記錄實(shí)驗(yàn)裸鼠的腫瘤細(xì)胞排列、分布、中央?yún)^(qū)壞死或凋亡。

2 結(jié)果

2.1 兩組組織形態(tài)學(xué)改變裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的成瘤率為100%(20/20)。組織形態(tài)學(xué)角度分析：與對照組比較，研究組顯著抑制裸鼠模型的肝轉(zhuǎn)移瘤形成；遞減或衰減肝轉(zhuǎn)移瘤的大小、肝體質(zhì)量、病灶間融合、肝表面隆凸及肝轉(zhuǎn)移評分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1及圖2A～C、圖2E～2G。

2.2 兩組組織病理學(xué)改變組織病理學(xué)角度分析：與對照組比較，研究組腫瘤細(xì)胞排列稀疏、邊緣型分布、浸潤深度淺、中央?yún)^(qū)壞死或凋亡成片，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖2D、2H。

3 討論

針對結(jié)直腸癌早期篩查、早期診斷的不斷豐富，并結(jié)直腸癌發(fā)病相關(guān)信號通路的揭示，且對結(jié)直腸癌浸潤和轉(zhuǎn)移規(guī)律的公示，顯著改善了結(jié)直腸癌術(shù)后的復(fù)發(fā)率和生存率[6]。但仍有一部分結(jié)直腸癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，由于結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具較強(qiáng)的特異性，且易發(fā)生在肝、肺等重要臟器，特別是以肝轉(zhuǎn)移為主導(dǎo)[7]。一旦發(fā)生結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移，治療難度增加、生存質(zhì)量下降、死亡率也劇增[8]。因此能否有效阻斷肝轉(zhuǎn)移對結(jié)腸癌的治療至關(guān)重要，特別是如能提早阻斷結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)尤為重要。

表1 兩組組織形態(tài)學(xué)變化比較

圖2 兩組結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的組織形態(tài)學(xué)和組織病理學(xué)變化 ×200

A：對照組解剖裸鼠大體觀；B：對照組肝臟正面觀；C：對照組肝臟背面觀；D：對照組肝臟顯微鏡下觀；E：研究組解剖裸鼠大體觀；F：研究組肝臟正面觀；G：研究組肝臟背面觀；H：研究組肝臟顯微鏡下觀

表2 兩組組織病理學(xué)變化比較

近期研究[9]證實(shí)，HOXB7基因在胚胎生殖細(xì)胞主要負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及遷移，并在成體細(xì)胞與上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)，且在惡性腫瘤細(xì)胞主要負(fù)責(zé)調(diào)控增殖、黏附、侵襲、遷移、凋亡。目前在諸多原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤中能檢測到高表達(dá)HOXB7。結(jié)腸癌細(xì)胞中通過阻斷HOXB7-RNAi表達(dá)，抑制Notch1信號通路，降低癌細(xì)胞的惡性增殖，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。肝癌細(xì)胞中也通過下調(diào)HOXB7表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的異常增殖、黏附、侵襲、遷移，并將細(xì)胞滯留于G0-G1期[11]。肺腺癌細(xì)胞中HOXB7為細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的重要調(diào)控因子，因此也為控制惡性腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的臨床防治新靶點(diǎn)[12]。

本研究證實(shí)，研究組顯著抑制裸鼠模型的肝轉(zhuǎn)移瘤形成；遞減或衰減肝轉(zhuǎn)移瘤的大小、肝體質(zhì)量、病灶間融合、肝表面隆凸及肝轉(zhuǎn)移評分；研究組腫瘤細(xì)胞排列稀疏、邊緣型分布、浸潤深度淺、中央?yún)^(qū)壞死或凋亡成片。充分能說明HOXB7基因敲減能有效抑制裸鼠模型的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤形成。本研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有如下優(yōu)勢：① HOXB7基因首次在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中研究；② SMZ-B2/T2體視顯微鏡輔助下完成模型的建立；③ 通過動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HOXB7基因敲減或敲除的成功構(gòu)建。

綜上所述，HOXB7基因敲減可有效抑制裸鼠模型的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤形成，至于具體的抑癌模式和量化標(biāo)準(zhǔn)的制定有待于進(jìn)一步考證。