高脂飲食對兔睪丸組織損害機(jī)制及光甘草定保護(hù)作用研究

韋雯雯，郭 燦，丁俊麗，呂正梅

一般認(rèn)為，肥胖的重要原因之一是長期攝入脂肪含量高的各類食物。而一系列疾病均可能由此引發(fā)，從而威脅現(xiàn)代人類健康。與之相關(guān)的代謝性異常是導(dǎo)致男性生育力低下/不育的重要原因之一[1]。光甘草定(glabridin, GLA)是經(jīng)由光果甘草中提取而來，富含黃酮類多酚[2]，它的抗氧化特性能夠明顯抑制代謝所產(chǎn)生的自由基、細(xì)胞壁和生物大分子等免受活性氧(reactive oxygen species，ROS)損傷[3]。在炎癥、心血管、腫瘤治療等方面多有報(bào)道[4-6]，相關(guān)研究[7]表明，GLA對高脂模型兔的血管能夠起到一定的保護(hù)作用。但在對肥胖相關(guān)代謝性疾病的睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能保護(hù)作用上尚未見報(bào)道，該研究采用此模型，探討GLA對肥胖相關(guān)代謝異常導(dǎo)致睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能受損的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制，為肥胖相關(guān)的男性生育力低下/不育提供可能的防治措施。

1 材料與方法

1.1 材料雄性新西蘭大耳白兔(18只，正常兔飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境室溫20～25 ℃左右，濕度55%～60%，光線明暗各12 h)購自山東青島康大集團(tuán)；普通級，體質(zhì)量(2.4±0.5)kg；GLA購自上海東蒼生物科技有限公司；膽固醇(cholesterol, CH)購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司AR級；抗β-actin、沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent information regulator 1, SIRT1)、類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)抗體購自美國Santa Cruz Cell Signaling公司；抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)GRP78/BiP (B前細(xì)胞中的免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，immunoglobulin heavy chain binding protein in pre-B cells，BiP)抗體購自英國Abcam公司；抗細(xì)胞色素P450 膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450 cholesterol side chain cleavage，P450scc)、錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase, MnSOD)、3β-羥類固醇脫氫酶(3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)、多克隆抗體F4/80購自武漢BOSTER、proteintech Group公司；脂質(zhì)氧化(malondialdehyde, MDA)檢測試劑盒、總抗氧化能檢測試劑盒[(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid, ABTS)快速法]購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 主要儀器電子天平FA1104購自上海精密科學(xué)儀器有限公司；VE-186轉(zhuǎn)膜電泳槽購自上海天能科技公司；四度離心機(jī)購自美國Thermo Fisher Scientific INC 公司。

1.3 方法

1.3.1高脂模型的建立 將18只雄性新西蘭大耳白兔隨機(jī)分3組。正常對照組(A組)：連續(xù)12周喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料；高脂模型組(B組)：連續(xù)12周喂養(yǎng)高脂飼料；GLA組(C組)：喂養(yǎng)高脂飼料(含5%豬油及1% CH)的同時(shí)，自第7周給予劑量2 mg/(kg·d)的GLA一直至第12周。

1.3.2標(biāo)本的制備 暴露兔耳緣靜脈，3%戊巴比妥鈉麻醉，取頸動(dòng)脈血，離心血清，取上清-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〕霾G丸標(biāo)記-80 ℃保存?zhèn)溆没虺Ｒ?guī)制作石蠟切片。

1.3.3血脂測定 使用全自動(dòng)化分析儀分析，酶偶聯(lián)比色法測試項(xiàng)目。

1.3.4免疫組織化學(xué)法 石蠟切片脫蠟脫水；組織抗原修復(fù)；封閉；滴加稀釋的一抗；滴加標(biāo)記二抗；滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液；DAB顯色。

1.3.5Western blot法 稱取組織標(biāo)本，冰上充分研磨按步驟提取蛋白。樣品與 SDS- PAGE蛋白上樣緩沖液按照4 ∶1混勻。蛋白變性后-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｅ淠z，電泳，電轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜，4 ℃孵育一抗過夜。次日洗膜，稀釋二抗，孵育，洗膜，使用ECL顯影曝光。

1.3.6脂質(zhì)氧化(MDA)檢測實(shí)驗(yàn) 取兔子睪丸組織，按照試劑盒說明書操作步驟檢測睪丸組織脂質(zhì)氧化水平。

1.3.7總抗氧化能力檢測(ABTS快速法) 取兔子睪丸組織，按照試劑盒說明書操作步驟檢測睪丸組織總氧化能力。

2 結(jié)果

2.1 GLA對高脂兔模型血脂的影響高脂模型組總膽固醇(total cholesterol,TCH )和三酰甘油(triglyceride, TG)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GLA給藥后，TCH下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TG有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組兔血清中TCH和TG含量的比較

與正常對照組比較：*P<0.05；與高脂模型組比較：#P<0.05

2.2 睪丸間質(zhì)細(xì)胞3β-HSD及巨噬細(xì)胞抗F4/80抗體表達(dá)變化3β-HSD抗體特異性標(biāo)記睪丸間質(zhì)細(xì)胞，陽性染色呈棕黃色。高脂模型組較對照組陽性表達(dá)明顯變?nèi)酰籊LA給藥表達(dá)有所增強(qiáng)；抗F4/80抗體特異性標(biāo)記巨噬細(xì)胞，高脂飲食后陽性染色細(xì)胞數(shù)量增加；經(jīng)治療數(shù)量減少。見圖1、2。

2.3 GLA對高脂模型兔睪酮合成相關(guān)蛋白的影響Western blot研究轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StAR及合成類固醇酶P450scc水平變化。結(jié)果顯示，經(jīng)高脂飲食12周后，較對照組StAR、P450scc表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；GLA治療6周，StAR、P450scc表達(dá)有所增加(P<0.05)。見圖3。β-actin作為內(nèi)參。t檢驗(yàn)顯示，與正常對照組比較，高脂模型組P450scc(t=3.997,P<0.05)和StAR(t=7.201,P<0.05)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與高脂模型組比較，GLA組P450scc(t=4.290,P<0.05)和StAR(t=3.287,P<0.05)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 兔睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色 ×100

圖2 兔睪丸組織巨噬細(xì)胞細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色 ×100

圖3 Western blot法檢測各組兔睪酮合成相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化

A：正常對照組；B：高脂飲食組；C：GLA組；與正常對照組比較：*P<0.05；與光甘草定組比較：#P<0.05

2.4 GLA對高脂模型兔睪丸組織中抗氧化系統(tǒng)的影響

2.4.1Western blot檢測結(jié)果 高脂飲食12周后，較正常對照組，SIRT1、MnSOD和人谷脫甘肽過氧化酶4(human glutenin peroxidase 4，GPx4)表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。而GLA組可見SIRT1、MnSOD和GPx4表達(dá)增加(P<0.05)。見圖4。β-actin作為內(nèi)參，采用t檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，高脂模型組GPx4(t=3.264,P<0.05)、MnSOD(t=4.929,P<0.05) 和SIRT(t=4.415,P<0.05)；水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與高脂模型組相比，GLA組GPx4(t=3.246,P<0.05 ) 、MnSOD(t= 6.484,P<0.05) 和SIRT(t=3.709,P<0.05)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4.2脂質(zhì)氧化變化 高脂模型組MDA較正常對照組濃度升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而GLA組MDA濃度下降明顯，甚至低于正常對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。采用t檢驗(yàn)，分別為高脂模型組與正常對照組比較，以及GLA組與高脂模型組比較。

圖4 Western blot法檢各組兔睪丸組織中主要抗氧化物蛋白水平變化

A：正常對照組；B：高脂飲食組；C：GLA組；與正常對照組比較：*P<0.05；與GLA組比較：#P<0.05

圖5 高脂模型兔脂質(zhì)氧化變化

2.4.3總抗氧化能力測定 ABTS快速法在414 nm測定ABTS+的吸光度即可測定并計(jì)算出組織的總抗氧化能力。結(jié)果顯示，與對照組比較，高脂飲食組的組織總抗氧化能力降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；GLA給藥后總抗氧化能力明顯升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖6。采用t檢驗(yàn)，分別為高脂模型組與正常對照組比較，以及GLA組與高脂模型組比較。

圖6 各組兔睪丸組織總抗氧化能力變化

2.5 GLA對高脂模型兔睪丸組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響Western blot技術(shù)檢測睪丸組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78表達(dá)變化。與對照組比較，高脂模型組表達(dá)升高。GLA組較高脂模型組表達(dá)有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖7。β-actin作為內(nèi)參，采用t檢驗(yàn)，分別為高脂模型組與正常對照組比較，以及GLA組與高脂模型組比較。

圖7 Western blot法檢測各組兔睪丸組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子水平變化

3 討論

學(xué)術(shù)界對因肥胖導(dǎo)致的相關(guān)代謝性疾病并因而引發(fā)男性的生殖功能減退的問題一直非常關(guān)注[8]。該類疾病的成因多樣化，但是其中因高糖、高膽固醇飲食習(xí)慣以及長期缺乏運(yùn)動(dòng)是較為重要的因素。

對于那些高脂飲食喂養(yǎng)的雄性小鼠，其睪丸組織呈現(xiàn)出超微結(jié)構(gòu)下的損傷，其睪丸間質(zhì)細(xì)胞線粒體的數(shù)目出現(xiàn)減少[9]。本研究用 Western blot法檢測兔睪丸組織StAR和P450 scc在高脂模型組中的表達(dá)均較正常對照組下調(diào)；抗3β-HSD抗體高脂組陽性表達(dá)明顯變?nèi)?；血清TCH、TG均升高。給藥后StAR和 P450 scc表達(dá)較高脂組上調(diào)；抗3β-HSD抗體表達(dá)有所增強(qiáng)；TCH下降。

由肥胖引發(fā)的代謝異常以及由其導(dǎo)致的睪酮合成下調(diào)的另一個(gè)重要原因是睪丸間質(zhì)內(nèi)環(huán)境改變[10]。氧化應(yīng)激對于睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮以及精子發(fā)生都易產(chǎn)生影響，睪丸局部代謝狀態(tài)可能由于高脂飲食而發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的蓄積并使得氧化應(yīng)激得到激發(fā)。MnSOD和GPx4是抗氧化防御系統(tǒng)中最重要的酶組分，當(dāng)它們的對在細(xì)胞內(nèi)蓄積的ROS難以消除，則細(xì)胞大分子會(huì)受到氧化破壞，繼而加劇了氧化應(yīng)激。 SIRT1可使得k基因結(jié)合核因子(nuclear factor-k-gene binding，NF-kB)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子等去乙酰化，在保護(hù)線粒體的功能方面非常重要，能夠抑制細(xì)胞死亡、延緩衰老，應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞得以更多自我修復(fù)[11]。本研究采用Western blot法檢測到SIRT1、MnSOD、GPx4在高脂模型組表達(dá)下調(diào)，吸光度值分析，睪丸組織因高脂飲食使得脂質(zhì)氧化有所增加，同時(shí)，總抗氧化能力出現(xiàn)弱化。GLA給藥后，SIRT1、MnSOD、GPx4表達(dá)上調(diào)，脂質(zhì)氧化減輕，總抗氧化能力增加。睪丸間質(zhì)中浸潤的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和ROS，引起睪丸間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)了氧化應(yīng)激，引致線粒體的功能損傷，同時(shí)合成睪酮蛋白/酶的表達(dá)受到抑制[12]。本研究顯示高脂飲食后，睪丸間質(zhì)中巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，給藥后，數(shù)量有所減少。

近年來，有觀點(diǎn)認(rèn)為氧化應(yīng)激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激存在交叉作用[13]。氧化應(yīng)激通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的正確折疊引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的產(chǎn)生可以使ROS釋放，加重氧化應(yīng)激[14]。做為分子伴侶，BiP/GRP78可以感知錯(cuò)誤折疊蛋白以及參與非折疊蛋白的反應(yīng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中發(fā)揮重要作用[15]。本研究數(shù)據(jù)顯示，高脂模型組GRP78表達(dá)升高，經(jīng)過GLA干預(yù)，表達(dá)有下降趨勢。

綜上所述，本研究結(jié)果支持以下基本結(jié)論：模型兔血脂由于高脂飲食導(dǎo)致了紊亂，以及睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮相關(guān)蛋白/酶出現(xiàn)了下降，睪丸間質(zhì)微環(huán)境改變；GLA通過調(diào)節(jié)模型兔的代謝狀態(tài)，減輕睪丸間質(zhì)氧化應(yīng)激，發(fā)揮保護(hù)睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能的作用。