淫羊藿苷對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化的影響及機(jī)制研究

安 慶，劉國(guó)雄，Bikash Kumar Sah，周 霖，庹 偉，曹 洪

淫羊藿苷(icariin，ICA)分子式：C33H40O15，分子量：676，是抗骨質(zhì)疏松中藥淫羊藿的有效成分之一[1]。研究[2]表明，ICA可促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收，提高骨密度及影響骨代謝指標(biāo)，具有明顯的抗骨質(zhì)疏松作用。然而，對(duì)其作用機(jī)制及分子機(jī)制方面的研究仍不夠全面[3]，故ICA在預(yù)防骨質(zhì)疏松方面仍需要更深入地研究。該實(shí)驗(yàn)以小鼠顱頂前成骨細(xì)胞亞克隆14(mouse embryo osteoblast precursor cells, MC3T3-E1 subclone 14)為細(xì)胞模型，研究ICA對(duì)其細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖活性以及細(xì)胞堿性磷酸酶(acid phosphatase, ALP)活性的影響，同時(shí)研究骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)BMP-2/(small mothers agalnst decapentaplegic，Smad)Smads信號(hào)通路在其中的作用，為ICA治療骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑小鼠顱頂前成骨細(xì)胞亞克隆14(MC3T3-E1 subclone 14)細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物科技公司；CCK-8試劑盒購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所；ALP檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；頭蛋白(noggin)購(gòu)自美國(guó)R&D公司，目錄號(hào)：1967-NG-025；兔多克隆抗體BMP-2(ab14933)、兔多克隆抗體骨形態(tài)發(fā)生蛋白2受體(bone morphogenic protein receptor-2, BMPR-2)(ab96826)、兔單克隆抗體Smad4(ab40759)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔多克隆抗體Smad1/5/8/9 (NB100-56443)購(gòu)自美國(guó)Novus公司。ICA標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品北京檢定所，目錄號(hào)：T2855，純度為99%(HPLC檢驗(yàn))。

1.2 方法

1.2.1淫羊藿苷儲(chǔ)備液 取2 mg ICA加入2 ml DMSO中制成1 mg/ml的儲(chǔ)備液保存于-20 ℃。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋儲(chǔ)備液制成含不同濃度ICA(0、10、20、40 ng/ml)的培養(yǎng)液備用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) MC3T3-E1細(xì)胞完全培養(yǎng)液為含10% FBS的高糖DMEM，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，向各實(shí)驗(yàn)組中加入含不同濃度ICA(0、10、20、40 ng/ml)的培養(yǎng)液，每2 d換液1次。

1.2.3細(xì)胞蘇木精-伊紅(HE)染色 取第3代MC3T3-E1細(xì)胞接種于24孔板，用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后更換含不同濃度ICA(0、10、20 、40 ng/ml)的培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)48、72、96 h。HE染色法對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行染色，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 CCK-8法檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活性。將第3代MC3T3-E1細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞培養(yǎng)方法同HE染色部分。根據(jù)CCK-8操作說(shuō)明向每孔中加入10 ul檢測(cè)液，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)每孔細(xì)胞光密度值(optical density, OD)并計(jì)算出每組細(xì)胞相對(duì)增殖活性。

1.2.5檢測(cè)細(xì)胞ALP活性 ALP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性。取第3代MC3T3-E1細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞培養(yǎng)方法同HE染色部分。根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明裂解并離心細(xì)胞后取上清液，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于405 nm波長(zhǎng)檢測(cè)上清液OD并計(jì)算出各組細(xì)胞ALP相對(duì)活性。

1.2.6Western blot 將MC3T3-E1培養(yǎng)的細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿，細(xì)胞培養(yǎng)方法同HE染色部分：① 細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解后，離心取上清液；② 用BCA法檢測(cè)上清液蛋白質(zhì)濃度；③ 分別用5%的濃縮膠和12%分離膠分離蛋白質(zhì)；④ 分別孵育一抗BMP-2(1 ∶1 000)，BMPR-2(1 ∶1 000)，Smad4 (1 ∶1 000)，Smad1/5/8/9 (1 ∶200)和β-actin (1 ∶1 000)和二抗后顯色。

2 結(jié)果

2.1 ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡下見(jiàn)48、72h組細(xì)胞形態(tài)飽滿(mǎn)，呈多角形或梭形，各ICA濃度間細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1、2。

圖1 ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)的影響(48 h) HE×100

A：0 ng/ml ICA；B：10 ng/ml ICA；C：20 ng/ml ICA；D：40 ng/ml ICA

圖2 ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)的影響(72 h) HE×100

A：0 ng/ml ICA；B：10 ng/ml ICA；C：20 ng/ml ICA；D：40 ng/ml ICA

96 h組鏡下見(jiàn)細(xì)胞排列緊密，部分細(xì)胞伸出突起，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核較清晰，各ICA濃度間細(xì)胞亦無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖3。結(jié)果提示ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯影響。

圖3 ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)的影響(96 h) HE×100

A：0 ng/ml ICA；B：10 ng/ml ICA；C：20 ng/ml ICA；D：40 ng/ml ICA

2.2 ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性的影響各組在培養(yǎng)48、72、96 h后，10、20 ng/ml ICA組細(xì)胞增殖活性較對(duì)照組(ICA，0 ng/ml )顯著增強(qiáng)(P均< 0.01)，其中20 ng/ml ICA組細(xì)胞活性更強(qiáng)，并且于96 h時(shí)細(xì)胞增殖活性達(dá)到最高，而40 ng/ml ICA組細(xì)胞活性與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4A。向細(xì)胞中加入Noggin，觀察ICA(20 ng/ml)與Noggin(100 ng/ml)共同培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞72 h后對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果顯示各指標(biāo)在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=102.7，P<0.01)。與ICA(20 ng/ml)組比較，ICA+ Noggin組細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制(P<0.01)；與ICA(0 ng/ml)組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4B。

圖4 ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活力的影響及阻斷BMP/Smads信號(hào)通路后的變化

A: ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活力的影響；B: 阻斷BMP/Smads信號(hào)通路后ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性的影響；與0 ng/ml ICA組比較：**P< 0.01

2.3 ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性的影響各組在培養(yǎng)48、72、96 h后，10和20 ng/ml ICA組細(xì)胞ALP活性較對(duì)照組顯著增高(P均<0.01)，40 ng/ml ICA組細(xì)胞ALP活性與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5A。向細(xì)胞中加入Noggin，觀察ICA(20 ng/ml)與Noggin(100 ng/ml)共同培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞72 h后對(duì)細(xì)胞ALP活性的影響。結(jié)果顯示各指標(biāo)在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.10，P<0.01)。與ICA(20 ng/ml)組比較，ICA+ Noggin組細(xì)胞ALP活性受到抑制(P<0.01)；與ICA(0 ng/ml)組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5B。

2.4 ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞BMP-2、BMPR-2、Smad1/5/8和Smad4蛋白表達(dá)的影響Western blot分析，結(jié)果顯示各指標(biāo)在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=98.22、96.17、146.35、123.10，P<0.01)。各組在培養(yǎng)48、72、96 h后，10、20 ng/ml ICA組細(xì)胞BMP-2、BMPR-2、Smad1/5/8和Smad4蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著增加(P均<0.01)，40 ng/mlICA組細(xì)胞上述蛋白表達(dá)水平少量增加，但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖6。

圖5 ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性的影響及阻斷BMP/Smads信號(hào)通路后的變化

A: ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性的影響；B: 阻斷BMP/Smads信號(hào)通路后ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性的影響；與0 ng/ml ICA組比較：*P<0.05

2.5 Noggin對(duì)ICA促M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞BMP-2、BMPR-2、 Smad1/5/8 和Smad4蛋白表達(dá)的影響向細(xì)胞中加入Noggin(100 ng/ml)，觀察不同濃度ICA與Noggin共同培養(yǎng)48、72、96 h后對(duì)細(xì)胞BMP-2、BMPR-2、Smad1/5/8和Smad4蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示各指標(biāo)在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.099、1.731、1.098、1.951，P>0.05)。加入Noggin后，細(xì)胞BMP-2、BMPR-2、Smad1/5/8和Smad4蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組差異無(wú)顯著性，ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞BMP-2、BMPR-2、Smad1/5/8 和Smad4蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用均受到抑制，見(jiàn)圖7。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是威脅中老年人健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)老年人骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率高達(dá)70%[4]。骨質(zhì)疏松易導(dǎo)致患者骨折，進(jìn)一步會(huì)導(dǎo)致殘疾、終身喪失獨(dú)立生活能力甚至死亡。同時(shí)，患者生活質(zhì)量的降低，死亡率的升高，會(huì)給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[5]。雙磷酸鹽是治療骨質(zhì)疏松的重要藥物，但是最近的研究[6]卻發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期服用雙膦酸鹽并不一定能降低骨質(zhì)疏松癥患者骨折的風(fēng)險(xiǎn)。雌激素是治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的有效藥物，然而長(zhǎng)期使用人工合成的雌激素可能會(huì)增加子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌及深靜脈血栓疾患的風(fēng)險(xiǎn)[7]。因此，尋找一種更為安全有效的治療骨質(zhì)疏松的藥物是防治的重要任務(wù)。

ICA具有較強(qiáng)的促進(jìn)成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的能力[8]。Song et al[9]研究表明，ICA可通過(guò)上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原和細(xì)胞周期蛋白E基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ICA可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖，并且其作用具有濃度依賴(lài)性特點(diǎn)。

圖6 ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞BMP-2、BMPR-2、Smad1/5/8 和 Smad4蛋白表達(dá)水平的影響

與0 ng/ml ICA組比較：*P<0.05

圖7 Noggin對(duì)ICA誘導(dǎo)的BMP-2、BMPR-2、Smad1/5/8 和Smad4蛋白表達(dá)水平的影響 1：ICA 0 ng/ml+Noggin組；2：ICA 10 ng/ml+Noggin組；3：ICA 20 ng/ml+Noggin組；4：ICA 40 ng/ml+Noggin組

ALP是參與骨代謝的重要蛋白，亦是成骨細(xì)胞分化成熟的早期標(biāo)志之一[10]。隨著成骨細(xì)胞不斷分化，ALP活性也逐漸增強(qiáng)，其活性大小可反映成骨細(xì)胞的分化水平。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ICA具有顯著的促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分化作用，其作用亦具有濃度依賴(lài)性特點(diǎn)。

BMPs是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β) 家族成員之一，骨組織中含量豐富，在骨的誘導(dǎo)和形成方面發(fā)揮重要作用[11]。BMPs促分化作用主要通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)ALP活性、骨鈣素和膠原蛋白的合成及分泌而發(fā)揮作用。BMP-2被認(rèn)為是TGF-β家族中活性最高且唯一能單獨(dú)誘導(dǎo)成骨的因子，BMP-2的高表達(dá)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化[12]。SMADS 家族是TGF-β超家族的下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，Smad4作為SMADS的公共遞質(zhì)在SMAD家族成員中十分重要，是TGF-β家族成員在細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的必經(jīng)之路。細(xì)胞外的BMPs與細(xì)胞膜上的 BMPR結(jié)合后導(dǎo)致受體激酶的激活，活化的受體會(huì)磷酸化細(xì)胞內(nèi)的Smadl/5/8，其與Smad4形成復(fù)合物后進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合到DNA序列上，從而調(diào)節(jié)下游成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[13]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ICA可能通過(guò)上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞BMP-2蛋白的表達(dá)，激活BMP-2/Smads信號(hào)通路，啟動(dòng)下游成骨相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)了MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、分化。

Noggin是BMP的抑制劑，能夠競(jìng)爭(zhēng)性與BMPs受體結(jié)合，下調(diào)BMPs的活性。為了進(jìn)一步研究BMP-2/Smads信號(hào)通路在MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化中的作用，向細(xì)胞中加入BMP抑制劑Noggin(100 ng/ml)，再次觀察上述指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示，加入Noggin后，ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性及ALP活性的促進(jìn)作用均受到明顯抑制。同時(shí)ICA對(duì)BMP-2/Smads信號(hào)通路中BMP-2、BMPR-2、Smad4和Smadl/5/8等相關(guān)蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用明顯下降。以上結(jié)果顯示，阻斷BMP-2/Smads信號(hào)通路可抑制ICA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化的促進(jìn)作用，表明該信號(hào)通路在MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、分化中發(fā)揮重要作用。