瞬時電位受體通道TRPA1/TRPV1在煙草致氣道上皮細(xì)胞損傷中的作用

王沐昀，徐蒙蒙，李 鋒，張 海，陳宇清，閆雪波，張妍蓓

氧化應(yīng)激是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的重要發(fā)病機(jī)制之一[1]。活性氧(reactive oxygen species，ROS)可能來自香煙煙霧，是COPD最重要的危險因素[2]。瞬時電位受體離子通道(transient receptor potential， TRP)是一類離子通道蛋白，位于細(xì)胞膜。TRP通道是Ca2+滲透性陽離子通道，它通過直接允許Ca2+流入細(xì)胞以應(yīng)對各種刺激，或使膜電位去極化來調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[3]。其中，TRPA1和TRPV1在炎癥形成和組織損傷中發(fā)揮主要作用[4-5]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來源，參與COPD的發(fā)病機(jī)制[6]。線粒體的結(jié)構(gòu)和功能受其分裂/融合過程的調(diào)控[7]。線粒體分裂由動力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1， DRP1)和線粒體裂變因子(mitochondrial fission factor，MFF)蛋白調(diào)控，而線粒體融合由線粒體融合蛋白1(mitofusions 1，MFN1)和線粒體融合蛋白2(mitofusions 2，MFN2)及視神經(jīng)萎縮蛋白1(optic atrophy 1，OPA1)蛋白調(diào)控[8]。線粒體的功能除了產(chǎn)生ROS，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原信號通路、細(xì)胞增殖和凋亡、先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答包括核苷結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域類似受體3[nucleotide-binding oligomerization domain(Nod)-like receptor 3，NLRP3]炎性小體[5]。NLRP3炎性小體含有NLRP3受體、適配器蛋白即凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing，ASC)和半胱氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate-specific proteinases，Caspase-1)。該研究擬通過建立香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract,CSE)誘導(dǎo)的氣道上皮損傷模型，探討TRPA1/TRPV1在該模型中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料人支氣管上皮細(xì)胞系Beas-2b細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自以色列BioInd公司；100 U/ml青霉素和鏈霉素100 μg /ml購自美國Thermo Fisher Scientific公司；萬寶路香煙購自龍巖煙草工業(yè)有限公司；TRPA1抑制劑(A967079、AMG9810購自美國Abcam公司；細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 購自日本東仁公司；DCFH-DA (D6883)購自美國Sigma-Aldrich公司；MitoSOX Red 購自美國Invitrogen公司；蛋白濃度測定試劑盒、Fluo-4 AM (鈣離子熒光探針，2 mg/ml)和蛋白裂解液RIPA購自南京碧云天公司；TRIzol試劑、Prime ScriptTM RT Master Mix Kit、Power Green qPCR Mix 購自大連TaKaRa公司；DRP1、 MFF、OPA1、 MFN2、NLRP3、Caspase-1和β-Tubulin抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Cell signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) Beas-2b細(xì)胞接種于無菌培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2、95%相對濕度的培養(yǎng)箱中孵育，細(xì)胞單層貼壁生長。實(shí)驗(yàn)取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，以0.25%胰酶消化傳代收集。

1.2.2CSE的制備 采用萬寶路香煙，去除過濾嘴后點(diǎn)燃，用氣體采樣管 (大包氏管) 采集香煙主流煙霧，2個串聯(lián)的大包氏管內(nèi)各裝有5 ml無血清的 DMEM 培養(yǎng)基作為吸收液，端連接香煙，另一端連接50 ml注射器，以50 ml/min的速度抽吸香煙2支、 每支煙抽吸10次，然后將該溶液調(diào)整pH值為7.40并用直徑0.22 μm 濾膜過濾，去除細(xì)菌和顆粒，制備成100% CSE，30 min內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞分組 體外培養(yǎng)支氣管上皮細(xì)胞Beas-2B細(xì)胞，分為空白組、CSE組、A967079(100 μmol/ml )+CSE組、AMG9810(100 μmol/ml +CSE組、A967079(100 μmol/ml)+AMG9810(100 μmol/ml)+CSE組。

1.2.4細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的 Beas-2B細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個/ml，取100 μl種于96孔板，每組設(shè)6個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，分別在每孔加入CSE、CSE+抑制劑， 96 孔板四周孔用培養(yǎng)基填充，96 孔板置于5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后，每孔加入10% CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀測定96孔板在450 nm處的光密度(optical delnsity，OD)值即OD450 nm。

1.2.5Ca2+檢測實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種到96孔的黑色板中，密度為5×104/ml，每組6個復(fù)孔。抑制劑實(shí)驗(yàn)組是使用抑制劑預(yù)處理1 h后，所有實(shí)驗(yàn)組接受CSE處理2 min。PBS清洗后加入5 μm Fluo-4，避光孵育30 min。PBS清洗3次，使用Flexstation?2 fluorescence plate reader在OD488/516 nm檢測OD值，并使用熒光顯微鏡拍照。

1.2.6氧化應(yīng)激檢測 使用DCFH-DA檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，細(xì)胞接種到96孔的黑色板中，密度為5×104/ml，每組6個復(fù)孔。分別在每孔加入CSE、CSE+抑制劑，24 h后，加入10 μm DCFH-DA 在37℃溫箱中避光孵育15 min，無血清1640清洗3次，在488/525 nm測定OD。 使用Mito SOX RED檢測線粒體氧化應(yīng)激， 細(xì)胞接種到96孔的黑色板中，密度為5×104/ml，每組6個復(fù)孔。分別在每孔加入CSE、CSE+抑制劑，24 h后，加入5 mmol/L MitoSOX Red 探針，在37 ℃溫箱中避光孵育10 min，PBS清洗3次，在OD510/580 nm處測定OD值和熒光顯微鏡拍照。

1.2.7qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 檢測抗氧化酶[血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)；醌氧化還原酶1(NAD(P)H:quinoneoxidoreductaseNQO1:EC1.6.99.2，NQO1)；錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)；過氧化氫酶(catalase，CAT)]和炎癥因子[白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、IL-1β、IL-18、IL-33]的mRNA水平。將各組細(xì)胞1×107，取1 ml TRIzol抽提細(xì)胞總RNA。利用TAKARA Prime Scirpt逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時定量PCR按SYBRII Premix Ex TaqTM(TAKARA)試劑盒說明書操作。引物序列見表1。

表1 抗氧化酶和炎癥因子的引物序列

1.2.8Western blot實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞1×107加入蛋白裂解液，BCA定量法計(jì)算蛋白的濃度。取30 μg總蛋白進(jìn)行凝膠電泳(恒壓 100 V)，檢測細(xì)胞中、線粒體分裂蛋白(DRP1 和 MFF)、線粒體融合蛋白(OPA1和MFN2)、NLRP3、Caspase-1 的蛋白表達(dá)情況， 以β-tubulin 作為內(nèi)參，用 Image J 軟件進(jìn)行相關(guān)灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)、制圖使用GraphPad Prism 6.0軟件。假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)按α=0.05 判定，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制劑預(yù)處理可減輕CSE對細(xì)胞增殖和細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響與空白對照、5% CSE、10% CSE相比，15% CSE刺激導(dǎo)致細(xì)胞增殖明顯降低，因此選擇10% CSE進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(98.31±36.44，F(xiàn)=32.48)。在10% CSE與細(xì)胞共培養(yǎng)的情況下，A967079、AMG9810、A967079+AMG9810對細(xì)胞增殖無明顯的影響，各指標(biāo)每組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.034，P>0.05)。10% CSE刺激對細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流的影響具有時間依賴性，并且在2 min達(dá)到峰值。表明CSE刺激可以激活細(xì)胞內(nèi)鈣通道，顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流，A967079(98.45±8.17)、AMG9810(96.72±8.17)、A967079+AMG9810(92.77±9.95)顯著降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平(F=14.99，P<0.001，P<0.001，P<0.001)，各指標(biāo)每組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

2.2 抑制劑預(yù)處理可減輕CSE對細(xì)胞內(nèi)ROS和線粒體ROS的影響10% CSE刺激導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高(164.64±4.89，P<0.001)。A967079(113.37±5.89)、AMG9810(118.02±4.99)、A967079+AMG9810(103.69±7.53)抑制細(xì)胞內(nèi)ROS水平(P<0.001，P<0.001，P<0.001)，各指標(biāo)每組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=78.77)。10% CSE刺激增加線粒體ROS水平(137.88±8.64，P<0.001)。A967079(122.79±3.17)、AMG9810(121.79±4.61)、A967079+AMG9810(118.44±4.99)均可抑制細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS水平(P<0.01，P<0.01，P<0.001)，各指標(biāo)每組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.84)。見圖2。

圖1 抑制劑預(yù)處理可減輕CSE對細(xì)胞增殖和細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響

A： 不同濃度CSE刺激對細(xì)胞增殖的影響；與15% CSE組比較：***P<0.001；B：10% CSE、抑制劑對細(xì)胞增殖的影響；C：10% CSE引起不同時間點(diǎn)Beas-2b細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化；與0 min組比較：***P<0.001；D：抑制劑對10% CSE誘導(dǎo)的2 min時細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響；與10% CSE組比較：***P<0.001

2.3 抑制劑預(yù)處理可減輕CSE對抗氧化酶mRNA表達(dá)的影響10% CSE刺激降低細(xì)胞的HO-1、NQO1和CAT 的mRNA表達(dá)(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。A967079增加NQO1和CAT mRNA表達(dá)(P<0.001，P<0.001)。AMG9810增加CAT mRNA(P<0.001)。A967079+AMG9810增加HO-1、NQO1、MnSOD mRNA表達(dá)(P<0.001，P<0.001，P<0.001)，各指標(biāo)每組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FHO-1=28.72，F(xiàn)NQO1=57.41，F(xiàn)MnSOD=35.4，F(xiàn)CAT=31)。見圖3。

圖2 抑制劑預(yù)處理可減輕CSE對細(xì)胞內(nèi)ROS和線粒體ROS的影響

A:10% CSE對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)；B:10% CSE對線粒體ROS水平的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)；與10% CSE組比較：**P<0.01，***P<0.001

圖3 抑制劑預(yù)處理可減輕CSE對抗氧化酶mRNA表達(dá)的影響

A:10% CSE對細(xì)胞HO-1的mRNA表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)；B:10% CSE對細(xì)胞NQO1的mRNA表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)；C:10% CSE對細(xì)胞MnSOD的mRNA表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)；D:10% CSE對細(xì)胞CAT 的mRNA表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)；與10% CSE組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.4 抑制劑預(yù)處理可減輕CSE對炎癥因子mRNA表達(dá)的影響10% CSE刺激增加細(xì)胞的IL-8、IL-1β、IL-18、IL-33 mRNA表達(dá)(P<0.001，P<0.01，P<0.001，P<0.001)。A967079降低細(xì)胞的IL-1β、IL-18、IL-33 的mRNA表達(dá)(P<0.001，P<0.05，P<0.05)，AMG9810降低細(xì)胞的IL-8、IL-18、IL-33 的mRNA水平(P<0.001，P<0.001，P<0.001)。A967079+AMG9810降低細(xì)胞的IL-1β、IL-18、IL-33的mRNA表達(dá)(P<0.001，P<0.001，P<0.001)，各指標(biāo)每組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FIL-8=28.72，F(xiàn)IL-1β=57.41，F(xiàn)IL-18=35.4，F(xiàn)IL-33=31)，見圖4。

2.5 抑制劑預(yù)處理可減輕CSE對線粒體分裂/融合蛋白表達(dá)的影響線粒體分裂/融合蛋白的代表性圖見圖5。10% CSE刺激增加DRP1、MFF的蛋白表達(dá)，減少OPA1蛋白表達(dá)(1.38±0.20，1.67±0.33，0.80±0.07，P<0.05，P<0.001，P<0.01)。A967079減少DRP1、MFF蛋白(0.81±0.07，0.74±0.19，P<0.01，P<0.001)，增加MFN2蛋白(1.45±0.41，P<0.05)，AMG9810減少M(fèi)FF蛋白(0.75±0.23，P<0.001)，增加MFN2蛋白(1.38±0.30，P<0.05)，A967079+AMG9810減少DRP1、MFF蛋白(0.86±0.12，0.68±0.13，P<0.05，P<0.001)，增加OPA1、MFN2蛋白(1.46±0.38，1.43±0.29，P<0.05，P<0.05)，各指標(biāo)每組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

2.6 抑制劑預(yù)處理可減輕CSE對NLRP3炎癥小體的影響10% CSE刺激增加NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)(P<0.001,P<0.05)。A967079降低NLRP3蛋白(0.89±0.06，P<0.05)，AMG9810降低Caspase-1蛋白(1.08±0.16，P<0.05)。A967079+AMG9810降低NLRP3、Caspase-1蛋白(P<0.001，P<0.01)。各指標(biāo)每組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.81±0.07，0.99±0.19，F(xiàn)NLRP3=11.08，F(xiàn)Caspase-1=5.629)，見圖6。

圖4 抑制劑預(yù)處理可減輕CSE對炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

A:10% CSE對細(xì)胞IL-8的mRNA表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)；B:10% CSE對細(xì)胞IL-1β的mRNA表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)；C:10% CSE對細(xì)胞IL-18的mRNA表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)；D:10% CSE對細(xì)胞IL-33的mRNA表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)；與10% CSE組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖5 10% CSE對細(xì)胞DRP1、MFF、OPA1、MFN2的蛋白表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)

A:10% CSE對細(xì)胞DRP1、MFF 蛋白表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)蛋白應(yīng)激圖；B: 10% CSE對細(xì)胞DRP1蛋白表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)；C: 10% CSE對細(xì)胞MFF蛋白表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)；D: 10% CSE對細(xì)胞OPA1，MFN2 蛋白表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)蛋白應(yīng)激圖；E: 10% CSE對細(xì)胞OPA1蛋白表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)；F:10% CSE對細(xì)胞MFN2蛋白表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)；與10% CSE組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

本研究證實(shí)煙霧暴露引起氣道上皮細(xì)胞的損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、線粒體損傷和炎癥反應(yīng)。在Beas-2b細(xì)胞中，CSE培養(yǎng)誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，增加細(xì)胞內(nèi)和線粒體ROS，降低抗氧化酶mRNA表達(dá)，增加炎癥因子mRNA表達(dá)，介導(dǎo)線粒體分裂/融合蛋白的失平衡，即線粒體分裂蛋白增加，線粒體融合蛋白減少。同時CSE增加NLRP3和Caspase-1的表達(dá)水平。單獨(dú)應(yīng)用或聯(lián)合TRPA1、TRPV1抑制劑可以減少細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、線粒體損傷以及下游炎癥反應(yīng)，預(yù)防線粒體分裂/融合蛋白的失平衡，下調(diào)NLRP3炎癥小體，其中聯(lián)合使用效應(yīng)好于單獨(dú)使用。以上結(jié)果表明TRPA1和TRPV1通路在煙霧誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞損傷模型中發(fā)揮重要的作用。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是煙霧暴露誘導(dǎo)上皮細(xì)胞損傷的主要機(jī)制之一。它是細(xì)胞中氧化還原平衡相對于抗氧化狀態(tài)轉(zhuǎn)移到促氧化狀態(tài)的一種情況，可能是與氧化劑種類的增加或自由基清除劑以及抗氧化酶水平的降低有關(guān)[9]。在Beas-2b細(xì)胞中，CSE共培養(yǎng)誘發(fā)線粒體ROS和細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生過量，這一現(xiàn)象與CSE共培養(yǎng)降低Beas-2b細(xì)胞中抗氧化酶mRNA水平有關(guān)。A967079、AMG9810、A967079+AMG9810均可降低CSE引起的細(xì)胞內(nèi)和線粒體ROS升高。同時， A967079、AMG9810、A967079+AMG9810可以增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶表達(dá)mRNA水平。本研究表明TRPA1和TRPV1通道在煙霧暴露誘導(dǎo)肺部細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的作用。這一過程可能與CSE誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流增加有關(guān)，抑制TRPA1/TRPV1通道可抑制細(xì)胞內(nèi)的Ca2+內(nèi)流。

圖6 10% CSE對細(xì)胞NLRP3、caspase-1的蛋白表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)

A:10% CSE對細(xì)胞NLRP3、Caspase-1 蛋白表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)蛋白應(yīng)激圖；B: 10% CSE對細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)；C: 10% CSE對細(xì)胞Caspase-1蛋白表達(dá)的影響及抑制劑的干預(yù)效應(yīng)；與10% CSE組比較：P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

COPD[10]和哮喘[11]患者均存在氣道上皮細(xì)胞線粒體功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體外膜滲透，凋亡蛋白釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在本研究中，CSE使Beas-2b細(xì)胞內(nèi)的線粒體分裂/融合蛋白失衡，這種獲得性線粒體功能障礙可能在COPD的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而A967079、AMG9810、A967079+AMG9810可以部分或完全地預(yù)防CSE誘導(dǎo)的線粒體分裂/融合蛋白失平衡。表明煙草暴露會通過TRPA1/TRPV1通路影響線粒體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而損害氣道上皮細(xì)胞的線粒體功能。本研究表明，CSE介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)和線粒體氧化應(yīng)激、誘發(fā)線粒體結(jié)構(gòu)和功能障礙，這兩者之間可能互為因果，相互影響。

體外研究[12]顯示，在肺泡上皮細(xì)胞(A549細(xì)胞)和支氣管上皮細(xì)胞中，ROS導(dǎo)致炎癥介質(zhì)基因表達(dá)增加。ROS作用于TRPA1和TRPV1通道激活NLRP3，刺激Caspase-1激活，從而導(dǎo)致IL-1β和IL-18分泌[13]。另外，NLRP3炎癥小體在COPD的發(fā)病機(jī)制過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。本研究中，CSE暴露增加Beas-2b細(xì)胞的炎癥因子mRNA水平，增加NLRP3和Caspase-1蛋白的表達(dá)，A967079、AMG9810、A967079+AMG9810均可以部分或完全地抑制炎癥因子水平，部分或完全地抑制NLRP3炎癥小體通路。這表明CSE通過TRPA1/TRPV1-NLRP3炎癥小體通路誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)。抑制TRPA1/TRPV1可以抑制NLRP3炎癥小體，抑制細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)。

本研究表明，TRPA1和TRPV1通過調(diào)控氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和線粒體損傷而參與CSE誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞損傷。靶向抑制TRPA1、TRPV1具有預(yù)防CSE誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞損傷的作用。與單獨(dú)抑制TRPA1或TRPV1相比，同時抑制TRPA1和TRPV1能更好地抑制CSE誘導(dǎo)的氣道上皮損傷。