小鼠中樞組胺能神經元的特異性投射環路

徐永霞，沈顯琦，葛夢臨，季 月，田 龍，卞浩東，許 奇

中樞組胺能神經元位于下丘腦后部的結節乳頭核(tuberomammillary nucleus，TMN)，參與覺醒、學習與記憶等高級神經功能調節[1-2]。傳統的辣根過氧化物酶或生物素化葡聚糖胺等神經示蹤方法研究發現結節乳頭核神經主要投射至內側隔區、丘腦及前腦等腦區[3]。但這些神經示蹤方法缺乏特異性，且中樞組胺能系統調控腦高級行為的功能環路仍不明確。近年來，借助Cre-LoxP重組酶技術可將人源綠色熒光蛋白(humanized Renilla green fluorescent protein，hrGFP)特異性表達在某一特定類型神經元，解析其神經投射環路[4]。該研究擬借助組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase，HDC)-Cre小鼠，將腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)攜帶的hrGFP特異性表達在TMN組胺能神經元，旨在揭示中樞組胺能神經元的特異性投射環路，為進一步研究其神經功能環路提供解剖學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級雄性HDC-Cre及其野生型(wild type，WT)小鼠8 ～10周齡，體質量22～24 g。小鼠自由攝食、飲水，室溫(22±1)℃，濕度(60±2)%，明暗周期12 h(07:00～19:00)。實驗遵守安徽醫科大學《實驗動物管理條例》。

1.1.2試劑 AAV-lox-Stop-hrGFP(日本筑波大學Lazarus M教授贈送)；兔抗鼠HDC抗體(貨號：AB37291，英國Abcam公司)；驢抗兔Alexa Fluor?594抗體(貨號：711-585-152，美國Jackson ImmunoResearch公司)；胎牛血清(貨號：B2064)、Triton-X 100(貨號：T8787)均購自美國Sigma-Aldrich公司；多聚甲醛(貨號：80096618)、水合氯醛(貨號：30037517)、蔗糖(貨號：10021418)、磷酸氫二鈉(貨號：10026310)、磷酸二氫鈉(貨號：20040718)、氯化鈉(貨號：10019318)均購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3儀器 冰凍切片機(型號：CM1900，德國Leica公司)；脫色搖床(型號：SK-O180-E，美國Scilogex公司)；磁力攪拌器(型號：MS7-H280-Pro，美國Scilogex公司)；腦立體定位儀(型號：68001)、立體手術顯微鏡(型號：77002)、高速顱骨鉆(型號：78001)均購自深圳瑞沃德生命科技有限公司；壓力微量注射推進器(型號：Picospritzer III，美國Parker公司)；熒光顯微鏡(型號：BX51，日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1動物手術 水合氯醛(350 mg/kg)麻醉小鼠，將HDC-Cre或WT小鼠固定于腦立體定位儀，定位至結節乳頭核(AP:-2.54，MR:+0.6，DV:-5.65 mm)。用高速顱骨將顱骨鉆通，但不損傷硬腦膜，借助氣體壓力推進微注射系統將AAV-lox-Stop-hrGFP(20 nl)經玻璃微注射針緩慢注射至結節乳頭核，留針5 min后縫合皮膚[5]。術后恢復及飼養4周。

1.2.2免疫熒光染色 術后4周，水合氯醛(500 mg/kg)深麻醉小鼠，用0.01 mol/L PBS經心灌注小鼠，再用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS固定，取出腦組織并經4%多聚甲醛后固定6～8 h，將腦組織依次經過10%、20%和30%蔗糖脫水。待組織完全脫水后行冰凍切片機切片，片厚30 μm。采用漂片法進行免疫熒光染色，將一套全腦切片在室溫下用含10%胎牛血清與0.3% Triton-X 100的0.01 mol/L PBS進行封閉1 h，將腦片轉至含兔源HDC抗體(1 ∶500)的PBS中孵育，4 ℃過夜。第2天將腦片用0.01 mol/L PBS浸洗6次，每次5 min，避光條件下將腦片轉至含有Alexa Fluor?594驢抗兔IgG(1 ∶100)的0.01 mol/L PBS內，室溫下孵育1 h，0.01 mol/L PBS清洗后裱片、封片。

1.2.3圖像采集與統計分析 封片后的組織切片在熒光顯微鏡拍照，紅色熒光為HDC陽性神經元，綠色熒光為hrGFP陽性神經元及神經末梢。圖片經圖像處理軟件Image J統一進行對比度、亮度、色彩平衡等調節以獲得更好的顯示效果。首先在低倍顯微鏡(×4)下找到各核團邊界，進一步在高倍顯微鏡(×100)下找到hrGFP陽性神經元或其神經末梢。借助圖像處理軟件Image J將hrGFP陽性神經末梢的熒光強度分為豐富、大量、中等、少量+。

1.3 統計學處理采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，計數資料組間比較選用行列表χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結節乳頭核組胺能神經元的形態特點立體定位微注射法將AAV-lox-Stop-hrGFP微量注射至HDC-Cre小鼠TMN(圖1A)。熒光顯微鏡下觀察顯示HDC-Cre小鼠表達hrGFP的神經元都位于結節乳頭核內(圖1B)，而WT小鼠結節乳頭核內未發現hrGFP陽性信號，即WT小鼠腦內沒有hrGFP表達(圖1C)。進一步驗證hrGFP在組胺能神經元表達的特異性，免疫熒光雙標結果顯示hrGFP陽性神經元(圖1D)同時HDC染色也呈陽性(圖1E)，hrGFP與HDC共定位在同一類神經元，即本實驗中hrGFP陽性神經元均為組胺能神經元(圖1F)。

2.2 小鼠腦內組胺能神經元的特異性投射中樞組胺能神經元(hrGFP陽性神經元)的軸突廣泛投射至外側下丘腦、大腦皮層、海馬、丘腦及腦橋等幾乎整個中樞神經系統。其中，hrGFP陽性神經纖維密集投射至基底前腦、伏隔核、尾殼核、腹外側視前區等腦區，也投射至中腦多巴胺能腹側被蓋區及黒質致密部，以及腦干及腦橋多個核團，可能與組胺能神經調控睡眠-覺醒行為有關(圖2)。組胺能神經元在腦內為雙側投射，以同側投射為主，其具體投射通路見表1。

圖1 hrGFP在HDC-Cre小鼠TMN組胺能神經元的表達免疫熒光

A:AAV模式圖及其微注射位置示意圖；B: hrGFP表達在HDC-Cre小鼠TMN ×10；C: WT小鼠TMN沒有hrGFP表達 ×10；D: TMN的hrGFP陽性神經元 ×100；E:TMN的HDC陽性神經元 ×100；F: hrGFP與HDC共定位同一類神經元 ×100

圖2 TMN組胺能神經元向腦內睡眠-覺醒相關腦區的特異性神經投射 免疫熒光×100

A：Cortex大腦皮層；B：NAc伏隔核；C：CPU尾殼核；D：LS外側隔核；E：BF基底前腦；F：LH外側下丘腦；G：VLPO腹外側視前區；H：PAG導水管周圍灰質；I：PB臂旁核

表1 TMN組胺能神經元hrGFP陽性神經末梢分布

3 討論

中樞組胺能神經元全部位于結節乳頭核，其神經纖維可廣泛投射至腦內其他核團及脊髓。既往對結節乳頭核神經元傳出投射路徑的研究主要來自傳統的辣根過氧化物酶等神經解剖學示蹤方法，但這類神經示蹤方法缺乏特異性，無法解析某一特定類型神經元的傳出或傳入通路[4,6]。比如結節乳頭核內除了含組胺能神經元外，還含有胞體較小的促甲狀腺激素釋放激素、甘丙肽、腦啡肽及P物質等多種不同神經元類型[7]。大量的傳統神經示蹤研究發現：結節乳頭核神經元主要由兩條上行通路和一條下行通路投射至全腦及部分脊髓。TMN神經投射的背側上行通路主要沿第三腦室兩側上行，經內側前腦束和到達前腦廣泛區域。腹側上行通路主要沿大腦基底部上行，投射至內側隔區、嗅結節及嗅球等腦區。下行通路主要投射至腦干核團和小腦、脊髓等[3]。采用hrGFP特異性神經示蹤技術顯示TMN中樞組胺能神經元投射的范圍與密度與傳統示蹤實驗結果有差異，比如，傳統示蹤方法研究報道TMN組胺能神經元密集投射至內側隔核，而hrGFP特異性示蹤發現TMN組胺能神經元主要投射至外側隔核。這可能與傳統的示蹤劑特異性差有關，投射至內側隔核的神經元可能是TMN的非組胺能神經元，比如腦啡肽陽性神經元或P物質陽性神經元。因此，本研究特異性揭示了中樞組胺能神經投射特點，為進一步研究中樞組胺能神經的功能及功能環路具有重要的指導意義。

中樞組胺能神經元參與調節覺醒、生物節律、情緒、體溫以及呼吸等多種神經功能。因此，闡明TMN組胺能神經元特異性投射環路將為研究其調節高級行為的功能環路提供堅實的解剖學基礎。TMN組胺能神經元及小膠質細胞均參與調控睡眠-覺醒行為[8-9]，隨著覺醒時間前額葉皮層組胺含量升高[10]，阻斷組胺H1受體促進睡眠[11]。本研究顯示TMN組胺能神經元特異性、密集投射至尾殼核、伏隔核、基底前腦、腹外側視前區、導水管周圍灰質等睡眠-覺醒相關神經核團，提示TMN組胺能神經元可能支配這些神經核團神經元活性調控睡眠-覺醒行為。借助hrGFP特異性神經示蹤技術，Zhang et al[6]發現伏隔核腺苷A2A受體陽性神經元向腹側蒼白球、TMN、腹側被蓋區等神經核團均有解剖學投射，提示其可能調控這些核團的神經活性調節睡眠-覺醒行為。Oishi et al[12]進一步借助光遺傳學、電生理學等研究手段發現伏隔核A2A受體陽性神經元通過調節腹側蒼白球神經元活性發揮其促睡眠作用。綜上，本研究闡明了TMN組胺能神經元在中樞神經系統內的特異性投射環路，為揭示其神經功能環路提供了有力的理論基礎和解剖學證據。闡明TMN組胺能神經元調控腦高級行為的功能環路，還需結合電生理學、光遺傳學、組織學及行為學等多種研究手段。