EZH2抑制劑DZNep對NK/T淋巴瘤細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響

張 梓，夏莎莎，夏瑞祥

人NK/T淋巴瘤是一種特殊類型的非霍奇金淋巴瘤，以鼻和面部中線部位破壞為主要表現(xiàn)，且有明顯的地域和種族易感性，多發(fā)于亞洲及南美洲，具有侵襲性高、預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)[1]。果蠅Zeste基因增強(qiáng)子人類同源物2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2)是多梳抑制復(fù)合體2(polycomb repressive complex 2, PRC2)中的核心亞基，具有組蛋白甲基化酶活性，能催化組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(trimethylation of histone H3 lysine27, H3K27me3)，在表觀遺傳學(xué)水平調(diào)控基因的表達(dá)[2]。而EZH2抑制劑DZNep (3-deazaneplanocin)作為EZH2蛋白的靶向抑制劑，能抑制EZH2的組蛋白甲基化酶活性，并能降解EZH2蛋白[3]。最新研究證實，EZH2在NK/T淋巴瘤組織中表達(dá)顯著增高，且與腫瘤細(xì)胞的異常增殖密切相關(guān)[4]。目前，在對NK/T淋巴瘤的研究中，針對EZH2的靶向治療鮮有報道，據(jù)此，該研究擬用EZH2抑制劑DZNep作用人NK/T淋巴瘤細(xì)胞株SNK-6，觀察其對EZH2蛋白水平的影響以及對SNK-6細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，進(jìn)而為該腫瘤的靶向治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系 人NK/T淋巴瘤細(xì)胞SNK-6細(xì)胞株購自上海信裕生物科技有限公司。

1.1.2藥品與主要試劑 DZNep購自美國APExBIO公司，以DMSO溶解儲存?zhèn)溆?；RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國HyClone公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、PI染色細(xì)胞周期檢測試劑盒均購自上海貝博公司；兔抗人EZH2、Cleaved PARP單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗人Cleaved Caspase-3抗體購自英國Abcam公司；兔抗人β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG均購自武漢塞維爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將NK/T淋巴瘤細(xì)胞株SNK-6置于含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈懸浮生長，每2～3 d換液并傳代，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將SNK-6細(xì)胞以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，用不同濃度(0.2、0.5、1、2、5 μmol/L)DZNep處理細(xì)胞，同時設(shè)對照組(不加藥物，加入等量DMSO)及空白組(只含培養(yǎng)液，無細(xì)胞)，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72 h后，加入CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測出波長為450 nm的吸光度(A450)值。實驗重復(fù)3次，取平均值，根據(jù)公式計算細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(A加藥組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%，以藥物濃度為橫軸，細(xì)胞增殖抑制率為縱軸，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.3PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 將細(xì)胞以1×106/ml的濃度接種于6孔板中，用不同濃度(0.2、1、5 μmol/L)DZNep處理細(xì)胞，并設(shè)立對照組(不加藥物，加入等量DMSO)，培養(yǎng)48 h后，離心(1 500 r/min，5 min)收集細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，用500 μl PBS重懸細(xì)胞，滴加5 ml冷乙醇4 ℃固定過夜，離心(2 000 r/min，10 min)收集細(xì)胞，冷PBS 洗滌2次，用500 μl冷PBS重懸細(xì)胞后加入Rnase A溶液20 μl，37 ℃水浴30 min，離心(2 000 r/min，10 min)收集細(xì)胞，加入400 μl PI染液重懸細(xì)胞，4 ℃避光孵育30 min，立即用流式細(xì)胞儀(BD FACSVerse)檢測細(xì)胞周期，用FlowJo軟件分析細(xì)胞周期百分比。

1.2.4Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞以2×105/ml的濃度接種于6孔板中，用不同濃度(0.2、1、5 μmol/L)DZNep處理細(xì)胞，并設(shè)立對照組(不加藥物，加入等量DMSO)，培養(yǎng)48 h后，離心(1 000 r/min，4 ℃，5 min)收集細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，用400 μl×Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，密度大約為1×106/ml，加入5 μl Annexin V-FITC染色液，4 ℃避光孵育15 min，加入10 μl PI染色液，4 ℃避光孵育5 min，立即用流式細(xì)胞儀(BD FACSVerse)檢測細(xì)胞凋亡率，用FlowJo軟件分析凋亡率。

1.2.5Western blot檢測 收集不同濃度DZNep處理48 h后的SNK-6細(xì)胞，用全細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒定量，加入上樣緩沖液，行SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，使用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h，TBST溶液速洗幾次，加入EZH2、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP及β-actin一抗(1 ∶1 000稀釋)4 ℃ 孵育過夜，次日用TBST溶液洗3次，加入二抗(1 ∶10 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST溶液洗3次，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光、顯影，用ImageJ分析軟件分析各條帶灰度值，目的蛋白的相對表達(dá)量以目的蛋白/內(nèi)參β-actin的灰度值表示。

2 結(jié)果

2.1 DZNep能抑制SNK-6細(xì)胞增殖不同濃度(0.2、0.5、1、2、5 μmol/L)DZNep分別處理SNK-6細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞增殖均受到不同程度抑制，各加藥組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=192.869、1 469.000、3 210.000，P<0.01)，且DZNep對SNK-6細(xì)胞株的增殖抑制作用存在時間-劑量依賴關(guān)系，見表1、圖1。

表1 CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖抑制率(%,n=3)

與對照組比較:**P<0.01

圖1 DZNep抑制 SNK-6細(xì)胞的增殖

2.2 DZNep能誘導(dǎo)SNK-6細(xì)胞發(fā)生G1/S期阻滯不同濃度(0.2、1、5 μmol/L)DZNep處理SNK-6細(xì)胞48 h后，統(tǒng)計得G1期細(xì)胞百分比分別為(41.25±1.76)%、(46.40±2.03)%、(54.78±1.18)%，S期細(xì)胞百分比分別為(52.47±0.68)%、(41.67±1.28)%、(36.70±1.54)%，對照組G1期和S期細(xì)胞百分比分別為(33.40±1.69)%、(60.21±0.82)%，各加藥組與對照組比較，G1期細(xì)胞百分比升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=56.296，P<0.01)，S期細(xì)胞百分比下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=175.098，P<0.01)，且均具有劑量依賴性，見圖2。

2.3 DZNep能誘導(dǎo)SNK-6細(xì)胞發(fā)生凋亡不同濃度(0.2、1、5 μmol/L)DZNep處理SNK-6細(xì)胞48 h后，統(tǒng)計得細(xì)胞凋亡率分別為(15.09±0.89%)、(23.37±1.11)%、(47.54±1.61)%，對照組細(xì)胞凋亡率為(4.42±0.34)%，各加藥組與對照組比較，細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=566.955，P<0.01)，且隨著藥物濃度升高，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，呈劑量依賴性，見圖3。

圖2 DZNep誘導(dǎo)SNK-6細(xì)胞 G1/S期阻滯

2.4 DZNep降解EZH2蛋白并誘導(dǎo)Cleaved Caspase-3及Cleaved PARP的產(chǎn)生不同濃度(0.2、1、5 μmol/L)DZNep處理SNK-6細(xì)胞48 h后，EZH2蛋白水平呈下降趨勢，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7 457.000,P<0.01)；Cleaved Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量逐漸上升，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=893.251,P<0.01)；Cleaved PARP蛋白的相對表達(dá)量逐漸上升，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1 118.000,P<0.01)，且均具有劑量依賴性，見圖4。

圖3 DZNep誘導(dǎo)SNK-6細(xì)胞發(fā)生凋亡

3 討論

NK/T淋巴瘤具有惡性度高、侵襲性強(qiáng)，預(yù)后不佳等特點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，現(xiàn)已知與EB病毒感染密切相關(guān)，因多原發(fā)于鼻腔，故又稱鼻型NK/T淋巴瘤。該病以血管中心性浸潤為特點(diǎn)，并伴有明顯的血管損傷和組織壞死。治療上，早期以局部放療為主，晚期以全身化療為主，化療方案可選擇以左旋門冬酰胺酶為主的聯(lián)合化療方案，高危和復(fù)發(fā)難治的患者則可考慮自體或異基因造血干細(xì)胞移植治療，但目前國際上仍無明確有效的治療方案[5]。故進(jìn)一步探究其發(fā)病機(jī)制以及尋求新的治療思路尤為重要。

圖4 DZNep降解EZH2蛋白并誘導(dǎo)Cleaved

EZH2基因位于染色體7q35～36上，包含20個外顯子和19個內(nèi)含子， EZH2蛋白由746個氨基酸構(gòu)成，具有組蛋白甲基化酶的活性，EZH2催化的組蛋白甲基化常與其他表觀遺傳學(xué)修飾，如DNA甲基化、組蛋白去乙?；认嚓P(guān)聯(lián)，共同發(fā)揮致癌作用[2]。近年來，研究[6-7]顯示EZH2在前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤中存在表達(dá)異常，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后以及耐藥性密切相關(guān)，其作用機(jī)制復(fù)雜多樣，具有特異性。在NK/T淋巴瘤中也存在EZH2表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象，但其并不是通過經(jīng)典的H3K27me3途徑發(fā)揮致癌作用，而是作為轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合到Cyclin D1的啟動子上，直接激活Cyclin D1的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異常增殖[4]。本課題組前期研究[8]顯示干擾EZH2基因可以增強(qiáng)NK/T淋巴瘤的化療敏感性。

DZNep是一種3-去氮腺苷的環(huán)戊醇類似物，它是第一個被發(fā)現(xiàn)的EZH2抑制劑。DZNep能有效抑制S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase，SAHH)水解S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine，SAH)，引起細(xì)胞內(nèi)SAH的積聚，并抑制S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)依賴的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，同時，DZNep能誘導(dǎo)EZH2的降解[3]。目前，在對前列腺癌、乳腺癌、胃癌等多種腫瘤的體外實驗[9-11]顯示，DZNep能通過干擾組蛋白修飾及miRNA等多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

本實驗選擇用EZH2抑制劑DZNep作用于SNK-6細(xì)胞株，觀察其對細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。DZNep在0.2～5 μmol/L的范圍內(nèi)可有效抑制SNK-6細(xì)胞株的增殖，并存在時間-劑量依賴性。同時，DZNep能誘導(dǎo)G1/S期阻滯，細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂結(jié)束到下一次分裂完成的全過程，包括分裂期和分裂間期兩個部分，分裂間期又包括DNA合成前期(G1期)，DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)。G1/S期轉(zhuǎn)換是指細(xì)胞由DNA復(fù)制前的物質(zhì)、能量準(zhǔn)備階段進(jìn)入DNA復(fù)制階段，G1/S期轉(zhuǎn)換失控是癌變的關(guān)鍵步驟[12]。本實驗結(jié)果表明DZNep能通過阻滯G1/S期轉(zhuǎn)換來抑制細(xì)胞異常增殖。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞生理性的自發(fā)死亡，受多種基因和信號通路的嚴(yán)密調(diào)控，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是腫瘤治療中的重要策略。本實驗運(yùn)用Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)證明DZNep能有效誘導(dǎo)SNK-6細(xì)胞發(fā)生凋亡。同時，Western blot結(jié)果顯示，隨著藥物劑量的增加，Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP水平呈上升趨勢。Cleaved Caspase-3是Caspase-3的激活形式，Caspase-3作為凋亡執(zhí)行的關(guān)鍵蛋白，正常情況下以無活性酶原的形式存在于胞質(zhì)中，當(dāng)?shù)蛲鰡訒r，Caspase-3被剪輯激活成Cleaved Caspase-3，而PARP作為Cleaved Caspase-3的底物，又被進(jìn)一步剪輯成Cleaved PARP。PARP具有DNA修復(fù)酶的功能，剪輯后的PARP喪失了DNA修復(fù)能力，促進(jìn)了凋亡的發(fā)生。Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP作為凋亡發(fā)生的分子標(biāo)志，其表達(dá)量的增加再次表明DZNep能誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。除此之外，隨著DZNep濃度的增加，EZH2蛋白水平呈下降趨勢，證明DZNep能有效降解EZH2蛋白。

以上實驗結(jié)果初步表明，DZNep能降解EZH2蛋白，并在體外抑制SNK-6細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)G1/S期阻滯、誘導(dǎo)凋亡發(fā)生并促進(jìn)Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP的產(chǎn)生。該結(jié)果為NK/T淋巴瘤的靶向治療提供了一定的參考，此后需完善其相關(guān)分子機(jī)制及上下游信號通路的研究，同時可進(jìn)一步探究DZNep與常規(guī)化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用效果，為NK/T淋巴瘤的治療提供更多的思路。