ApoJ基因修飾的骨髓間充質干細胞移植對腦出血大鼠凋亡的影響

普 絹，劉茂春，陳 慧，劉 亮，徐 斌，劉學良，鄭曉梅

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是神經科的常見疾病，其致殘率及死亡率均較高[1]。線粒體促凋亡因子Omi/HtrA2 Omi又稱HtrA2(high temperature requirement A),是存在于線粒體膜間隙的一種絲氨酸蛋白酶，李鳳 等[2]研究證明Omi/HtrA2有促進細胞凋亡的作用，近年來細胞凋亡在ICH后繼發性損傷中越來越受關注。載脂蛋白-J(apolipoprotein J，Apo J)[3]是一種多功能糖蛋白，在補體調節、凋亡調控、炎癥反應等過程中發揮重要作用。研究[4]表明ApoJ可能通過抑制補體級聯反應起到神經保護作用，目前國內外少有關于ApoJ對凋亡方面的研究。課題組前期實驗運用脂質體介導重組綠色熒光蛋白質粒(plasmid enhanced green florescence protein，pEGFP)pEGFP-N1-apoJ轉染大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)，經RT-PCR、免疫組化、Western blot等技術證明轉染后的ApoJ在BMSCs能夠穩定且大量表達[5-7]。將轉染好的BMSCs移植入大鼠ICH部位，通過Western blot檢測顯示ApoJ蛋白能在ICH大鼠腦組織中表達[8]。在前期實驗成果的基礎上，該實驗利用外源性ApoJ修飾的BMSCs干預大鼠ICH模型，通過RT-PCR、Western blot法檢測血腫周圍組織中Omi/HtrA2的含量，結合腦組織含水量、神經功能恢復情況，旨在探討外源性ApoJ對ICH后繼發性損傷的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑3～4月齡雄性SD大鼠110 只，體質量200～250 g，由西南醫科大學動物中心提供，大鼠在標準條件下飼養：溫度20～28 ℃，相對濕度(65±5)%，噪音85 dB以下，12 h光/暗周期，通風換氣8～12 次/h，每天給予營養飼料及足量清潔飲用水。脂質體LipofectaminTM2000及TRIzol Reagent試劑盒購自美國Invitrogen 公司；重組質粒pEGFP-N1-apoJ購自上海生博生物醫藥科技有限公司；BCA蛋白質濃度測定試劑盒購自美國Thermo公司；兔抗大鼠Omi多克隆抗體購自美國CST公司；兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體購自英國abcam公司；HRP標記山羊抗兔購自武漢Aspe生物技術有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser及SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒購自北京TaKaRa 公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1BMSCs的分離、培養及重組質粒轉染BMSCs 將2只雄性SD大鼠處死分離出股骨和脛骨,反復沖洗骨髓腔，離心，接種于培養瓶中。在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，按1 ∶3比例傳代培養。將第3 代BMSCs接種至6孔板中，按參考文獻[7]的方法，用脂質體介導重組pEGFP-N1-apoJ質粒瞬時轉染體外培養的BMSCs，轉染后6、24、48、72、96 h在熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光蛋白表達情況，收集轉染效率最高的BMSCs(轉染后72 h)，將細胞濃度調整為2×107個/ml備用。

1.2.2實驗分組及ICH模型的建立 將108只雄性SD大鼠隨機分為:ApoJ/BMSCs組、BMSCs組和生理鹽水(NS)組，每組36 只。腹腔注射3%水合氯醛麻醉大鼠，固定于腦立體定位儀上，定位右側尾狀核，鉆孔，斷尾取血，采用經典的“改良二次注血法”注血(50 ul)，緩慢退針，縫合切口。造模2 h后用改良神經功能評分法(modified neurological severity score，mNSS)對大鼠進行神經缺失評分[9]，8分以上視為造模成功。

1.2.3細胞移植及組織取材 造模成功后 24 h，分別移植30 μl轉染細胞懸液、BMSCs懸液和生理鹽水至3 組大鼠腦出血部位。移植后又分為1、3、5、7 d 4 個亞組，每亞組9 只。相應時間點腹腔麻醉各亞組大鼠，斷頭取腦，取組織標本備用。

1.2.4神經功能評分 移植后1、3、5、7 d對各亞組大鼠進行mNSS評分，mNSS評分總分18 分，分值越高表示神經功能越差，其中1～6 分為輕度損傷，7～12 分為中度損傷，13～18 分為重度損傷。

1.2.5測定腦組織含水量 各組大鼠完成神經功能評分后立即處死，取出腦組織秤濕重，再于100 ℃烤箱里烘烤24 h后秤干重，運用干濕重法計算腦組織含水量，其公式為：含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.6Western blot法檢測Omi/HtrA2 提取總蛋白，測定蛋白濃度。上樣行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉，加入稀釋好的一抗和GAPDH過夜，回收已稀釋的一抗，用TBST洗3次，再加稀釋好的二抗，孵育30 min，最后用TBST在搖床上洗4次，曝光、顯影、定影。

1.2.7熒光實時定量PCR 取血腫周圍腦組織約100 mg，提取總RNA；取10 μl RNA按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進行反轉錄合成第一鏈cDNA；采用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行PCR 擴增，同時擴增GAPDH作內參。

2 結果

2.1 BMSCs分離、形態學觀察起初BMSCs分離時呈圓形或橢圓形，大小不等。原代培養24 h后呈多角形、小梭形等多種形態。見圖1A。3～5 d后圓形細胞減少，梭形集落細胞互相融合。第6天梭形細胞集落增多，呈旋渦狀排列。見圖1B。傳至第3代時，得到純度較高、形態均一的細胞。

圖1 鏡下觀察原代培養的BMSCs形態

2.2 重組質粒轉染BMSCs后熒光觀察選取生長良好的第3代BMSCs用于轉染，轉染后分別在鏡下觀察6、24、48、72、96 h熒光表達情況，轉染后綠色熒光蛋白的陽性細胞表達逐漸增多，72 h時熒光表達最強。見圖2。隨后減少，說明轉染成功。

圖2 鏡下觀察第3代BMSCs轉染后72 h的形態 ×100

A：第3代BMSCs轉染后72 h的白光；B：第3代BMSCs轉染后72 h的熒光

圖3 Western blot法檢測ApoJ/BMSCs、BMSCs、NS作用于ICH大鼠第1、3、5、7天時Omi/HtrA2蛋白的表達水平

2.3 各組大鼠神經功能缺損評分ApoJ/BMSCs組第3、5、7 天各時間點mNSS評分低于BMSCs組和NS組，其中BMSCs組低于NS組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠不同時間點mNSS評分比較分)

與BMSCs組比較：*P<0.05；與NS組比較：#P<0.05

2.4 各組大鼠腦組織含水情況ApoJ/BMSCs組第1 、3 、5 、7天各時間點腦組織含水量低于BMSCs組和NS組，其中BMSCs組低于NS組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠不同時間點腦組織含水量比較

與BMSCs組比較：*P<0.05；與NS組比較：#P<0.05

2.5 各組Omi/HtrA2蛋白表達通過Western blot檢測，經過電泳后可見Omi/HtrA2和GAPDH兩條帶分別為36、37 ku，3組中均有表達。通過對各相應時間點3 組目的條帶與GAPDH條帶的灰度比值的統計分析，ApoJ/BMSCs組及BMSCs組Omi/HtrA2的表達隨著時間的逐漸延長而降低，其中ApoJ/BMSCs組Omi/HtrA2蛋白表達與另外兩組比較明顯降低，且BMSCs組又較NS組降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖3。

2.6 Omi/HtrA2 mRNA通過RT-PCR檢測，ApoJ/BMSCs組和BMSCs組的Omi/HtrA2 mRNA隨著時間的延長逐漸降低，其中ApoJ/BMSCs組的Omi/HtrA2 mRNA較BMSCs組和NS組明顯降低，BMSCs組各時間點的Omi/HtrA2 mRNA又較NS組顯著減低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4、圖4。此結果與Western blot檢查結果一致。

表3 各組不同時間點Omi/HtrA2蛋白表達的變化

與BMSCs組比較：*P<0.05；與NS組比較：#P<0.05

表4 各組不同時間點Omi/HtrA2 mRNA表達

與BMSCs組比較：*P<0.05；與NS組比較：#P<0.05

3 討論

ApoJ具有眾多生物學功能[10]，主要包括：脂蛋白的轉運、抗細胞凋亡、抑制補體激活、抗氧化應激等。近年來ApoJ 的神經保護作用越來越被國內外學者關注，目前大多關注于ApoJ對缺血性腦卒中、創傷性腦損傷及多種神經退行性疾病的保護作用，較少有關于ApoJ在腦出血方面的研究。近年來ICH后的繼發性損傷逐漸引起大家的關注，已有研究[4]表明，ApoJ作為一種補體抑制劑可能通過抑制補體級聯反應減少細胞凋亡和水腫，促進神經功能恢復。目前國內外對ICH后細胞凋亡中相關調節基因的研究較少，而細胞凋亡又是導致神經元損傷的重要因素，阻斷細胞凋亡有望成為改善ICH預后的有效治療手段。

圖4 Omi/HtrA2 和內參GAPDH的mRNA 表達擴增圖譜

ICH是非外傷性腦實質內血管破裂引起的出血，ICH后除血腫占位效應的直接破壞，還包括血腫周圍水腫、血腦屏障破壞、炎性細胞浸潤、自由基釋放、補體激活、細胞凋亡等造成的繼發性損傷。細胞凋亡是ICH后細胞死亡的主要方式，是基因控制的細胞程序性死亡，但引起ICH后細胞凋亡的機制尚不清楚，目前有兩個已知通路[11]:外源性凋亡通路和內源性凋亡通路(又稱線粒體通路)，其中以線粒體通路為主。線粒體的功能在細胞的存活與凋亡之間起著重要調節作用，此過程包括細胞色素C及Omi/HtrA2的釋放。Omi/HtrA2正常情況下是存在于線粒體膜間隙中的一種保護性蛋白[12]。ICH后，當細胞受到各種刺激時，線粒體膜通透性改變，Omi/HtrA2從線粒體膜間隙中釋放進入細胞質中與X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)結合，抑制XIAP活性，激活Caspase酶原，引起一系列水解反應，降解細胞蛋白導致細胞死亡。Yoshioka et al[13]研究表明在大腦缺血后釋放入細胞液中的Omi/HtrA2主要通過抑制XIAP的功能導致神經元損傷，促進神經細胞的凋亡，參與了腦缺血后的病理生理演變過程。

基于上述原因，本實驗旨在探討ApoJ基因對ICH后凋亡可能的影響機制，前期研究[5-7]已證實ApoJ基因能夠成功轉染BMSCs，且ApoJ蛋白能夠在ICH大鼠腦組織中表達，本實驗轉染結果與文獻[5]基本一致。本實驗通過RT-PCR、Western blot檢測血腫周圍組織中Omi/HtrA2的含量變化，結果顯示隨著時間的逐漸延長，AopJ/BMSCs組和BMSCs組的Omi/HtrA2表達均有所下調，其中AopJ/BMSCs組各時間點下調較BMSCs組均更明顯，從而推測ApoJ基因修飾的BMSCs較單獨的BMSCs能夠更好地減少ICH后Omi/HtrA2的表達。Cordero-Llana et al[14]研究也表明，當腦細胞受損時ApoJ蛋白表達上調，有減少細胞凋亡并促進神經前體細胞的分化的作用，本實驗結果與之相一致，ApoJ基因可能通過抑制細胞凋亡起到神經保護作用。

綜上，ApoJ基因可能通過抑制Omi/HtrA2介導的細胞凋亡減輕腦水腫，促進神經功能恢復，對ICH具有治療作用，但ApoJ抑制Omi/HtrA2介導凋亡的具體機制及信號通路需要進一步深入研究，為進一步探討ApoJ基因對腦出血的治療提供了新的理論依據。