丹參酮ⅡA抑制HT22海馬神經(jīng)元發(fā)生鐵死亡的機制研究

許 璐，湯其強

鐵死亡是一種鐵依賴的脂質(zhì)過氧化(lipid peroxidation，LPO)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡方式，這一死亡過程的標(biāo)志為細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧增多、線粒體變小以及線粒體膜密度較大[1]。研究[2-5]證明鐵死亡與各種疾病密切相關(guān)。腦組織由于具有豐富的多不飽和脂肪酸且抗氧化酶含量低等特點，極易產(chǎn)生自由基損傷神經(jīng)細(xì)胞，因此神經(jīng)系統(tǒng)與鐵死亡關(guān)系非常密切。因此,需要尋找一種新藥物來抑制鐵死亡。

丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA, Tan ⅡA)來源于我國傳統(tǒng)中藥丹參，廣泛應(yīng)用于臨床，主要用于治療心腦血管疾病。體外研究[6-9]表明，Tan ⅡA具有抗自由基損害、抗炎抗凋亡、降低神經(jīng)毒性、抗動脈硬化等作用。同時研究表明丹參酮ⅡA可以通過促進細(xì)胞中血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)的表達(dá)進而保護細(xì)胞[9-10]，神經(jīng)系統(tǒng)疾病中HO-1發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用從而保護神經(jīng)細(xì)胞，相關(guān)研究[5]顯示HO-1對腎臟近曲小管細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時具有保護作用，而在癌癥細(xì)胞中HO-1可促進細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[11]，但是它在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時的作用尚未可知。該實驗使用Erastin損傷HT22海馬細(xì)胞為模型，探索Tan ⅡA抑制海馬細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的機制研究。

1 材料與方法

1.1 材料Erastin、Tan ⅡA購自美國Selleck公司；鋅原卟啉IX(zinc protoporphyrin IX, ZnPP IX)購自瑞士ENZO Life Science公司；DMEM培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Lonsa公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(cell counter kit-8,CCK-8)和超氧化物陰離子熒光探針(dihydroethidium，DHE)購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；BODIPYTM581/591 C11購自美國Thermo fisher公司；特異性Fe2+熒光探針(FeRhoNoxTM-1)購于武漢百博翌科技有限公司；煙酸已可堿(hoechst)購于美國Sigma公司；HO-1和鐵蛋白(ferrtin)抗體購自美國abcam公司，半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)抗體購自美國Cell Signaling公司；小鼠HT22海馬細(xì)胞由上海交通大學(xué)實驗室所饋贈。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)HT22細(xì)胞于含5% CO2、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，生長在含10%血清的DMEM培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞密度約為70%～80%時可進行實驗。

1.3 CCK-8實驗在96孔板中種植HT22細(xì)胞，每孔中加入CCK-8溶液10 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，酶標(biāo)儀上讀取450 nm處的吸光值。細(xì)胞存活率每組按照以下公式計算：細(xì)胞存活率%=(處理組-空白對照組/(對照組-空白對照)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察在24孔板中種植HT22細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度長到約為60%～70%時，預(yù)處理藥物2 h，再加入0.5 μmol/L Erastin作用8 h后，在倒置顯微鏡下觀察相關(guān)細(xì)胞的形態(tài)，并拍照記錄。實驗重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞存活率檢測在24孔板中種植HT22細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度長到約為60%～70%時，預(yù)處理藥物2 h，再加入0.5 μmol/L Erastin作用8 h后，分別加入5 μl Hoechst溶液和細(xì)胞一起在37 ℃孵育15 min左右，在熒光顯微鏡下隨機照片記錄，應(yīng)用圖形分析軟件(Image J)計算出藍(lán)色熒光的的細(xì)胞數(shù)量，并對每組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平檢測在24孔板中種植HT22細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度長到約為60%～70%時，預(yù)處理藥物2 h，再加入0.5 μmol/L Erastin作用8 h后，加入5 μmol/L Dihydroethidium溶液和細(xì)胞一起在37 ℃孵育30 min左右，在熒光顯微鏡下隨機照片記錄，應(yīng)用圖形分析軟件(Image J)計算出紅色熒光的細(xì)胞數(shù)量，并對每組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平檢測在24孔板中種植HT22細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度長到約為60%～70%時，預(yù)處理藥物2 h，再加入0.5 μmol/L Erastin作用7 h后，加入1 μmol/L BODIPYTM581/591 C11溶液和細(xì)胞一起在37 ℃孵育1 h左右，在熒光顯微鏡下隨機照片記錄，應(yīng)用圖形分析軟件(Image J)計算出綠色熒光的強度的平均值(平均熒光強度，其數(shù)值大小能間接反映LPO水平的高低)，并對每組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次。

1.8 細(xì)胞內(nèi)活性鐵含量的檢測在24孔板中種植HT22細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度長到約為60%～70%時，預(yù)處理藥物2 h，再加入0.5 μmol/L Erastin作用7 h后，加入100 μl FeRhoNoxTM-1溶液和細(xì)胞一起在37 ℃孵育1 h左右，最后用Hank′s平衡鹽溶液(Hank's balanced salt solution, HBSS)清洗細(xì)胞2次，在熒光顯微鏡下隨機照片記錄，應(yīng)用圖形分析軟件(Image J)計算出紅色熒光的強度的平均值，并對每組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次。

1.9 細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白含量檢測在24孔板中種植HT22細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度長到約為60%～70%時，預(yù)處理藥物2 h，再加入0.5 μmol/L Erastin作用7 h后，將各組細(xì)胞用4%多聚甲醛后+冰甲醇固定后，PBS緩沖液洗3次，封閉1 h，分別滴加抗Ferritin抗體(濃度為1 ∶100)，4 ℃下孵育過夜后使用PBS緩沖液洗3次；再用二抗于37 ℃下孵育30～60 min，PBS緩沖液洗3次；封片，在熒光顯微鏡下隨機照片記錄，應(yīng)用圖形分析軟件(Image J)計算出熒光的強度的平均值，并對每組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次。

1.10 Western blot檢測HO-1和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)HT22細(xì)胞在100 mm培養(yǎng)皿中生長至約60%～70%時，給予不同的處理后加入100 μl細(xì)胞裂解液作用10 min后，超聲3次每次3 s，對上清液采用BCA法進行蛋白質(zhì)定量，在加入1×SDS，沸水中煮5 min。等量蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)過5%牛奶封閉1 h后加入抗HO-1、Cleaved Caspase-3或β-actin抗體(濃度均為1 ∶1 000),室溫 30 min，4 ℃過夜后加入二抗孵育1 h，ECL法使PVDF膜顯色，曝光，使用Image J軟件分析結(jié)果。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 Erastin誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的模型建立及Tan ⅡA不同濃度的篩選為建立誘導(dǎo)的細(xì)胞發(fā)生鐵死亡模型，本研究首先應(yīng)用不同濃度的Erastin對HT22細(xì)胞作用不同的時間，結(jié)果顯示0.5 μmol/L Erastin作用HT22細(xì)胞8 h后，細(xì)胞生長受到明顯的抑制，同時與正常組比較，細(xì)胞存活率為(57±3.2)%，經(jīng)單因素方差分析(F=214.236，P<0.01)，細(xì)胞損傷嚴(yán)重。故選此濃度作為最佳造模濃度。見圖1。HT22細(xì)胞中給予不同濃度的Tan ⅡA預(yù)處理2 h后加入0.5 μmol/L Erastin，結(jié)果顯示0.1 μmol/L Tan ⅡA起到明顯的保護作用，細(xì)胞存活率為(94.26±4.2)%與對照組比較存活率無明顯變化(F=46.543,P>0.05)，見圖2。

2.2 倒置顯微鏡下觀察和Hoechst染色確定Tan ⅡA對HT22細(xì)胞的保護作用0.5 μmol/L Erastin作用HT22細(xì)胞8 h后對細(xì)胞具有明顯形態(tài)學(xué)改變，并出現(xiàn)部分死亡，加入0.1 μmol/L Tan ⅡA對細(xì)胞具有明顯的保護作用(F=71.235)，而加入0.1 μmol/L Tan ⅡA+10 μmol/L Znpp后對細(xì)胞的保護作用消失。ZnPP為經(jīng)典的HO-1蛋白表達(dá)抑制劑。用Hoechst染色顯示Erastin使大量HT22細(xì)胞發(fā)生凋亡，而Tan ⅡA對細(xì)胞具有很好的保護作用。見圖3。

圖1 CCK-8檢測Erastin對HT22的細(xì)胞毒性

A：對照組；B：0.05 μmol/L Erastin處理組；C：0.5 μmol/L Erastin處理組；D：1 μmol/L Erastin處理組；與對照組(0 μmol/L)比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3 Tan ⅡA對Erastin損傷HT22細(xì)胞內(nèi)ROS、LPO的影響利用DHE、BODIPYTM581/591 C11檢測細(xì)胞內(nèi) ROS及LPO變化。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，Erastin組中細(xì)胞內(nèi)ROS和LPO顯著增高(F=172.412，P<0.001)，表明Erastin促進HT22細(xì)胞內(nèi)ROS和LPO生成；與對照組比較，Tan ⅡA組中細(xì)胞內(nèi)ROS和LPO升高沒有統(tǒng)計學(xué)意義(F=59.132，P>0.05)，而Tan ⅡA+ZnPP組中細(xì)胞內(nèi)ROS和LPO與對照組相比顯著升高(P<0.001)。實驗結(jié)果表明Erastin可以誘導(dǎo)HT22細(xì)胞內(nèi)ROS和LPO水平升高，而Tan ⅡA可以抑制HT22細(xì)胞內(nèi)ROS和LPO水平升高。通過加入HO-1抑制劑ZnPP，結(jié)果顯示含有Tan ⅡA+ZnPP細(xì)胞內(nèi)的ROS和LPO水平再次升高。因此推測Tan ⅡA可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)HO-1的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞內(nèi)ROS和LPO水平的升高。見圖4。

圖2 CCK-8檢測Tan ⅡA對HT22的細(xì)胞毒性

A：對照組； B：0.01 μmol/L Tan ⅡA預(yù)處理后加入Erastin 0.5 μmol/L；C：0.1 μmol/L Tan ⅡA預(yù)處理后加入Erastin 0.5 μmol/L；D：1 μmol/L Tan ⅡA預(yù)處理后加入Erastin 0.5 μmol/L；與對照組(0 μmol/L)比較：**P<0.01

圖3 倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化(×100)及Hoechst檢測各組細(xì)胞的存活率

A：對照組；B：Erastin組；C：Tan ⅡA組；D：Tan ⅡA+ZnPP組；E：細(xì)胞存活率柱狀圖；與Erastin組比較：*P<0.05，***P<0.001

2.4 Tan ⅡA對Erastin損傷HT22細(xì)胞內(nèi)活性鐵及鐵蛋白的影響為了確定細(xì)胞內(nèi)活性鐵的含量利用特異性Fe2+熒光探針(FeRhoNoxTM-1)進行檢測，實驗結(jié)果顯示，與對照組相比Erastin組中細(xì)胞內(nèi)活性鐵顯著增高(P<0.001)，表明Erastin誘導(dǎo)HT22細(xì)胞內(nèi)活性鐵的生成；Tan ⅡA組中細(xì)胞內(nèi)活性鐵與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Tan ⅡA+ZnPP組中與Erastin組相比細(xì)胞內(nèi)活性鐵降低，但與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=55.302,P<0.001)，見圖5，表明Tan ⅡA可以減少細(xì)胞內(nèi)活性鐵的含量。

圖4 DHE、BODIPYTM 581/591 C11檢測細(xì)胞內(nèi)ROS和LPO水平

A:細(xì)胞內(nèi)ROS相對變化水平；B：細(xì)胞內(nèi)LPO相對變化水平；a：對照組；b：Erastin組；c：Tan ⅡA組；d：Tan ⅡA+ZnPP組；與對照組比較：***P<0.001

圖5 FeRhoNoxTM-1探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性鐵的含量×100

A：對照組；B：Erastin組；C：Tan ⅡA組；D：Tan ⅡA+ZnPP組；E：細(xì)胞內(nèi)活性鐵含量相對變化水平；與對照組比較：***P<0.001

圖6 熒光顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白的表達(dá)免疫熒光×100

A：對照組；B：Erastin組；C：Tan ⅡA組；D：Tan ⅡA+ZnPP組；E：細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白相對表達(dá)水平；1：細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白熒光圖；2：細(xì)胞核染色圖；3：1和2的結(jié)合圖；與對照組比較：***P<0.001

通過加入HO-1抑制劑ZnPP，發(fā)現(xiàn)含有Tan ⅡA+ZnPP的細(xì)胞內(nèi)活性鐵含量升高。進一步探究HT22細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白的表達(dá)量，利用細(xì)胞免疫熒光進行檢測。實驗結(jié)果表明，與對照組比較，Erastin組中細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.001)，表明Erastin誘導(dǎo)HT22細(xì)胞鐵蛋白的生成；Tan ⅡA組中細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Tan ⅡA+ZnPP組中細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白的表達(dá)與Erastin組相比降低了，但與對照組比較F=12.365，P<0.001差異明顯，見圖6，表明Tan ⅡA能減少細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白的表達(dá)。實驗結(jié)果與活性鐵的含量檢測結(jié)果相同。說明Tan ⅡA能夠降低細(xì)胞內(nèi)活性鐵的含量以及鐵蛋白的表達(dá)，加入HO-1抑制劑能夠抑制Tan ⅡA發(fā)揮作用，說明Tan ⅡA可能通過誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)發(fā)揮作用。

2.5 Tan ⅡA對HT22細(xì)胞中HO-1和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響為了進一步研究Tan ⅡA對HT22細(xì)胞的保護機制，利用Western blot檢測細(xì)胞中HO-1和Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)。實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，Erastin組的HO-1的蛋白表達(dá)增多(P>0.05)， 而與Erastin組比較，Tan ⅡA組的HO-1的蛋白表達(dá)升高，Tan ⅡA+ZnPP組的HO-1的蛋白表達(dá)明顯降低，表明Tan ⅡA能促使HT22細(xì)胞內(nèi)HO-1蛋白的高表達(dá)。雖然Erastin組的HO-1蛋白表達(dá)量也增加，推測HO-1的表達(dá)是細(xì)胞抵抗死亡的自身反應(yīng)。而Tan ⅡA能夠誘導(dǎo)HO-1蛋白大量表達(dá)從而來抵抗細(xì)胞的死亡。為了驗證Erastin所引起的細(xì)胞死亡是否由凋亡引起，檢測了Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示在各組細(xì)胞內(nèi)Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)無明顯差異，表明Erastin損傷引起的細(xì)胞死亡是一種不依賴于經(jīng)典凋亡通路Caspase的細(xì)胞死亡。Tan ⅡA對HT22細(xì)胞的保護作用是通過高表達(dá)HO-1蛋白，從而抵抗細(xì)胞死亡。見圖7。

圖7 各組細(xì)胞處理后HO-1和Cleaved Caspase-3的表達(dá)

A：對照組；B：Erastin組；C：Tan ⅡA+ZnPP組；D：Tan ⅡA組；與對照組比較：***P<0.001；與對照組比較：###P<0.001

3 討論

鐵死亡是Dixon et al[1]在2012年提出的一種新的非凋亡的細(xì)胞死亡方式。鐵死亡發(fā)生時會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵依賴的脂質(zhì)過氧化物蓄積進而促進細(xì)胞死亡。研究[3]證明鐵死亡與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有著密切聯(lián)系，但是鐵死亡抑制劑很難通過血腦屏障，因此，探討Tan ⅡA抑制鐵死亡的損傷機制，對于治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要的意義。

研究[12]表明HO-1可將血紅素分解為鐵、膽紅素和一氧化碳，膽紅素可有效保護細(xì)胞膜、抵抗脂質(zhì)過氧化，從而保護機體免受氧化應(yīng)激損傷。而很多體外模型證實在HO-1被誘導(dǎo)而活性增高的同時，鐵蛋白的水平也同時升高，與HO-1相關(guān)的鐵蛋白表達(dá)量與細(xì)胞的抗損傷能力呈平行關(guān)系。考慮到HO-1將血紅素分解而產(chǎn)生的生物分子與鐵死亡的發(fā)生可能相關(guān)，同時相關(guān)研究證實HO-1在腎臟近曲小管細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時具有保護作用[5]，因此推測HO-1表達(dá)可能抑制神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

Tan ⅡA具有抗自由基損害、抗炎抗凋亡、降低興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、降低血脂、抗動脈硬化等作用[6-9]。研究[9-10]表明Tan ⅡA還可以通過促進HO-1表達(dá)進而發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用，進而保護細(xì)胞免受損傷。因此Tan ⅡA可能通過上調(diào)HO-1表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)鐵和脂質(zhì)過氧化物含量，減輕鐵死亡，從而對神經(jīng)細(xì)胞起到保護作用。

本研究應(yīng)用小鼠HT22海馬神經(jīng)元建立鐵死亡損傷模型探討Tan ⅡA抑制HT22細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的作用機制。Erastin是一種鐵死亡的誘導(dǎo)劑，作用于離體細(xì)胞能誘導(dǎo)出鐵死亡的各種損傷，包括細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多、LPO及活性鐵含量增多等。在本研究中，首先利用CCK-8確立了鐵死亡損傷模型中Erastin誘導(dǎo)劑使用的濃度和Tan ⅡA對細(xì)胞的有效保護濃度；根據(jù)細(xì)胞存活率結(jié)果確定應(yīng)用0.5 μmol/L Erastin作用HT22細(xì)胞建立鐵死亡損傷模型，并用0.1 μmol/L Tan ⅡA抑制HT22細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，研究觀察到，Eratin可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生損傷，并且顯示細(xì)胞內(nèi)活性氧、脂質(zhì)活性氧及活性鐵含量都明顯增加而加入Tan ⅡA后細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞內(nèi)活性氧、脂質(zhì)活性氧、活性鐵及鐵蛋白都受到了抑制。為了驗證Tan ⅡA能促進細(xì)胞內(nèi)HO-1的表達(dá)，利用HO-1抑制劑ZnPP作為通路抑制劑，研究結(jié)果顯示細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞內(nèi)ROS、脂質(zhì)活性氧、活性鐵及鐵蛋白都升高了。說明ZnPP抑制了Tan ⅡA對細(xì)胞的保護作用。為了進一步解釋推測，利用Werstern blot檢測HO-1和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，該實驗結(jié)果顯示Erastin損傷引起的細(xì)胞死亡是一種不依賴于Caspase的細(xì)胞死亡，同時證實了Tan ⅡA對HT22細(xì)胞的保護作用，是通過提高HO-1表達(dá)。這對于Tan ⅡA對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療研究具有重要意義。