出芽短梗霉新菌株RM1603產普魯蘭多糖條件優化及多糖分析

沈琦，張殿鵬，郝雅蕎,3，羅翔蓮,3，楊佳瑤，魏步云，李歐，趙洪新

1.浙江理工大學 生命科學學院，浙江省植物與次生代謝重點實驗室，浙江 杭州 310018；2.北京市農林科學院 植物保護環境保護研究所，北京 100097；3.沈陽師范大學 生命科學學院，遼寧 沈陽 110034

出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）又稱黑酵母，隸屬于半知菌類短梗霉屬，是具有細胞和菌絲2種形態，生活史極為復雜的類酵母型真菌，廣泛存在于水、土壤、深海底泥、植物表面等自然環境中[1]。不同來源的出芽短梗霉生長過程中可產普魯蘭多糖、黑色素、重油等具有重要經濟價值的代謝產物，特別是普魯蘭多糖是應有極為廣泛，極具開發價值的微生物多糖。

出芽短梗霉產生的普魯蘭多糖是類似葡聚糖、黃原膠的胞外、黏質水溶、非離子線性多糖，是一種特殊的微生物胞外多糖，分子式為其基本結構為由α-1，4糖苷鍵連接的麥芽三糖重復單位，經α-1，6糖苷鍵聚合而成的直鏈狀多糖，相對分子質量為 4.8×104～2.2×106，分子大小由菌株、培養條件等多種因素決定[2-4]。普魯蘭多糖具有結構靈活、可塑性、成膜性、黏結性、耐熱性、耐酸堿性等特性，在食品、石油、化工、醫藥行業，特別是藥物載體、靶向治療、醫學成像、組織工程、血漿置換、疫苗、分子伴侶活性等新興領域有特殊的應用，是性能優良的天然生物材料[5-7]。又因普魯蘭多糖無毒無害，對人體無副作用，2006年被確定為新增的4種食品添加劑之一[8]。

Bernier首次報道了產糖芽霉菌（Pullularia pullulans），即出芽短梗霉代謝過程中可產特殊的胞外黏質多糖，因而關于普魯蘭多糖的研究受到廣泛關注[9]。經過幾十年的努力，對約100株不同來源的出芽短梗霉從菌株篩選、產糖條件、發酵工藝、誘變育種、基因工程改造等方面做了大量工作，取得了豐富的研究成果[10-11]。但是不同菌株的產糖能力差別巨大，原始菌通常為20 g/L左右，極少數達60 g/L以上，且多數以專利的形式被一些公司占有，所以尋找和開發產糖高、副產物少的新菌株，一直受研究人員的高度關注。

本研究的出發菌株RM1603是實驗室從太湖近岸植物根際土壤中分離得到的一株可產胞外多糖的類真菌，分子鑒定確定其分類歸屬為出芽短梗霉。該菌在200 r/min、28℃培養60 h的條件下，胞外粗多糖產量達32.91 g/L，與目前報道的100多株出芽短梗霉菌相比，RM1603具有明顯的產糖優勢，是一株極具開發潛力的產糖新菌株。本研究在單因素確定最佳氮源、碳源及無機鹽的基礎上，利用正交試驗探究RM1603最佳發酵產糖條件，通過薄層層析和紅外光譜確定了多糖結構，為進一步提高RM1603的產糖能力奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

出芽短梗霉RM1603于2015年分離于太湖近岸植物根際土壤，由浙江理工大學微生物實驗室保存。

蔗糖、酵母浸粉、玉米漿、麥芽浸粉、ZnSO4、（NH4）2SO4、K2HPO4、KH2PO4、KCl購于國藥集團化學試劑有限公司；NaCl、蛋白胨、胰蛋白胨、無水乙醇購于上海生物工程有限公司。

變溫搖床（蘇州市培英實驗設備有限公司，HYG-B）；721紫外分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；離心機（賽默飛世爾科技中國有限公司，SL16R）；分析天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；傅立葉紅外光譜儀（Thermo公司）。

1.2 單因素實驗

在培養基A基礎上，碳源為蔗糖，以ZnSO4、KCl、KH2PO4、蛋白胨、玉米漿、胰蛋白胨、麥芽浸粉為單因素條件，配制相應發酵培養基，測定發酵過程中粗多糖的產量[12-13]。

每種培養基設3組生物學重復，150 mL三角瓶中裝50 mL培養基，200 r/min、28℃培養60 h后取20 mL培養物，2000 r/min離心20 min，取上清液10 mL，加入2倍體積的無水酒精，充分振蕩，4℃醇沉12 h（過夜），離心，棄上清液，收集沉淀，80℃烘干（恒重）稱重，得粗多糖質量，以粗多糖質量為依據，選出最佳培養基成分。

1.3 正交試驗

在單因素實驗結果的基礎上，確定發酵培養基優化正交試驗因素水平（表1）、最佳發酵工藝條件正交試驗因素水平（表2），由此設計正交試驗組，進行發酵實驗。

表1 發酵培養基優化正交試驗因素水平表

表2 發酵工藝條件優化正交試驗因素水平表

1.4 產糖曲線

根據正交試驗結果，RM1603菌株在最佳發酵培養基B、最佳發酵條件下，以發酵時間為變量，從發酵24 h開始至180 h為止，每12 h為一個取樣點測量普魯蘭多糖質量，繪制粗多糖產量變化曲線，確定RM1603產糖最佳發酵時間，進一步優化發酵條件。

1.5 多糖結構分析

1.5.1 多糖的分離純化 稱取1 g粗多糖，溶于蒸餾水，定容至25 mL，為粗多糖溶液。溶液中加5 mL氯仿異戊醇試劑，充分振蕩，4000 r/min離心20 min，靜止2 min，取上清，此步驟重復操作3次，得到不含蛋白雜質的上清液，即為多糖溶液。向多糖溶液中加入4倍體積的無水乙醇，4℃靜置8 h后12 000 r/min離心10 min，沉淀為多糖。利用DEAE纖維素柱層析及Sephadex G-100凝膠柱層析法對多糖進一步分離純化。

1.5.2 薄層層析分析 稱10 g硅膠干粉，加入0.02 mol/L的NaAC溶液 25 mL，充分攪拌混勻，平鋪在玻璃板上，振敲使其均勻，自然晾干，制成硅膠板，置于干燥器中待用[14]。

將0.05 g/mL的普魯蘭多糖標準液和粗提多糖樣品溶液各分成2份，每份3 mL，各取一份添加普魯蘭酶0.06 mL，室溫酶解8 h。將普魯蘭多糖標準液、多糖樣品液、普魯蘭多糖標準酶解液、多糖樣品酶解液分別點樣于硅膠層析板上，在展開劑中層析，待液體層析至硅膠板頂部后取出吹干，噴硫酸顯色劑，吹干后于110℃烘箱烘烤，觀察顯色反應。

1.5.3 紅外光譜測定[15]取KBr，分別按50∶3和12∶1與純化所得多糖和普魯蘭多糖充分研磨、混勻，在20 MPa壓力下壓片，將KBr空白片（不含樣品）放入傅立葉紅外光譜儀采集參比背景光譜，然后對待測樣品進行圖譜采集。

2 結果

2.1 單因素實驗

為了確定單因素氮源對RM1603產多糖的影響，選擇了酵母浸粉、蛋白胨、玉米漿、胰蛋白胨、麥芽浸粉分別作為惟一氮源，觀察出芽短梗霉菌發酵所得粗多糖產量。由圖1可知，以酵母浸粉為氮源的粗多糖產量顯著高于其他氮源實驗組，多糖產量最高達34.55±1.01 g/L，玉米漿和麥芽浸粉次之，蛋白胨和胰蛋白胨作為主要氮源的實驗組產糖最低，由此表明RM1603菌株產糖發酵的最佳氮源為酵母浸粉。

圖1 不同單因素（氮源、無機鹽）對RM1603粗多糖產量的影響

2.2 正交試驗

表3 發酵培養基優化正交試驗及結果

表4 發酵培養基優化正交試驗結果方差分析

根據表1設計培養基優化正交試驗組，如表3所示進行9組發酵培養[16]，試驗結果見表3、4。由方差分析結果可知，影響多糖產量的因素依次為K2HPO4＞酵母浸粉＞（NH4）2SO4＞蔗糖；4 個因素均對多糖產量有顯著影響，優化結果為蔗糖80 g/L、酵母浸粉 2 g/Lg/L。以此為基礎齡60 h、pH6.5、28℃、180 r/min培養72 h，出芽短梗霉菌RM1603多糖產量為43.9 g/L。

表5 發酵工藝條件優化正交因素水平及結果

根據表2設計發酵工藝條件優化正交試驗組，如表5所示進行8組發酵培養，試驗結果見表5、6。由方差分析結果可知，影響多糖產量的因素依次為溫度＞種齡＞pH＞轉速＞接種量＞發酵時間＞培養基體積，其中pH、培養基體積、種齡、溫度、轉速均對多糖產量有顯著影響。因此，最佳發酵條件為pH7、培養基體積25 mL、接種量1%、種齡60 h、溫度28℃、轉速160 r/min培養72 h。

綜上，整合最佳培養基與最佳發酵工藝條件后設7次重復，發酵產量分別為48.52、47.98、48.64、47.34、48.44、47.38 g/L，均值48.05 g/L。

2.3 產糖曲線

在180 h內，自24 h開始，每12 h的粗多糖產量變化如圖2所示。96 h時發酵進入平穩期，此時粗多糖產量最高為65.213±0.08 g/L；132 h后粗多糖產量呈下降趨勢，可能由于發酵液中碳源不足，導致RM1603利用了產出的普魯蘭糖。

表6 發酵工藝條件優化正交試驗結果方差分析

圖2 出芽短梗霉RM1603的產糖曲線

2.4 多糖鑒定

2.4.1 薄層層析 以涂布于支持板上的支持物為固定相，以合適的溶劑為流動相，對混合樣品多糖進行分離、鑒定和定量[14]。由于普魯蘭酶特異性水解普魯蘭多糖中的α-1，6糖苷鍵，對其他糖苷鍵無作用，因此普魯蘭多糖在特異性酶的作用下水解成麥芽三糖。普魯蘭多糖分子較大，留在起點，酶解后產生的麥芽三糖分子較?。▓D3A）。圖中標準品與樣品位置基本一致，兩者酶解后產物位置基本一致，說明普魯蘭多糖標準品酶解液與多糖樣品酶解液中都含麥芽三糖，由此推斷該多糖為普魯蘭多糖。

2.4.2 紅外光譜分析 多糖類化合物結構中的一些特殊功能基團可以呈現特殊的紅外吸收光譜特征，無論是醛糖、吡喃糖環或呋喃糖環的構象和糖苷鍵構型，還是糖脂、多糖、糖肽、糖蛋白的結構和構象等，均可通過紅外吸收光譜進行檢測，因此紅外光譜法是研究多糖化合物的重要方法[15]。紅外光譜圖見 3B，3000 cm-1和 1350～1400 cm-1處為糖類物質的特征吸收峰，普魯蘭多糖標準品的特征峰為1200～1030 cm-1處的υc=0峰和930～900 cm-1處的D-吡喃葡萄糖環振動峰。多糖樣品出現的特征峰與其基本一致，由此證實該多糖為普魯蘭多糖[4]。

圖3 多糖結構分析

3 討論

優化發酵培養基組成和發酵工藝條件是提高普魯蘭多糖產量、降低生產成本的主要途徑，也是挖掘菌株生產能力、開發其價值的重要手段。我們在確定氮源和無機鹽單因素對RM1603產糖影響的基礎上，采取正交試驗分析確定優化后的高產糖培養基和最佳發酵條件，使得RM1603的多糖產量從28.91提高至65.213 g/L，提高了約2.3倍，與文獻報道的100多株出芽短梗霉的普魯蘭糖產量相比，處于十分靠前的位置[7]。通常出芽短梗霉在發酵產胞外多糖過程中會產生一定量的黑色素，對普魯蘭多糖的產量和提取都有一定影響[5]。然而RM1603菌株在最佳發酵時間96 h內，表觀未見黑色素產生，發酵液仍然呈乳白色，隨著發酵時間的延長，發酵液顏色漸變為淡黃色，132 h后發酵液由淡黃色漸變為深黃色，且其黏稠度明顯降低，可能與普魯蘭多糖代謝、重油代謝及黑色素代謝等存在偶聯關系[18]；薄層層析、紅外光譜分析檢測RM1603菌株所產多糖的結構，與標準普魯蘭多糖對比結果一致，這與文獻報道普魯蘭多糖結果相似[8,14]，RM1603所產胞外多糖為普魯蘭多糖。因此，RM1603具有較強的產多糖能力，發酵性狀優良，是一株極具開發價值的出芽短梗霉新菌株。本研究也為從自然界中篩選高產普魯蘭多糖新菌株提供了參考。