人突觸小體相關蛋白25單克隆抗體的制備及初步鑒定

孫志杰，許永亮，劉凌志，付楚溪，熊向華，畢秀麗，張惟材

1.遼寧大學 生命科學院，遼寧 沈陽 110036；2.軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100071；3.沈陽藥科大學 生命科學與生物制藥學院，遼寧 沈陽 110016；4.沈陽師范大學，遼寧 沈陽 110034

突觸小體相關蛋白25（synaptosomal associated protein 25，SNAP25），是可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體蛋白（SNARE）復合物的組成部分之一[1]，它通過形成一個將突觸囊泡和突觸前膜結合在一起的緊密復合物使二者發生融合[2]，同時驅動神經遞質釋放過程中的胞吐作用，促進神經遞質乙酰膽堿的釋放[3]。

肉毒桿菌神經毒素（botulinum neurotoxins，BoNT）簡稱肉毒毒素，由厭氧的肉毒桿菌產生，是目前發現的毒性最強的蛋白毒素[4]。根據毒性的不同，可將肉毒毒素分為A～G共7種血清型。肉毒毒素由一條重鏈和一條輕鏈通過二硫鍵連接構成[5]。輕鏈是一種將Zn2+作為輔助因子的金屬蛋白酶，可以特異性地切割SNARE復合物中的SNAP25蛋白，使突觸囊泡無法與突觸前膜融合，抑制神經元釋放神經遞質乙酰膽堿，從而引發肌肉弛緩性麻痹，嚴重的肉毒中毒還可導致人畜死亡[6]。由于SNAP25是肉毒毒素輕鏈切割的底物，制備針對SNAP25的單克隆抗體，可以作為檢測抗體用于肉毒毒素活性的檢測。

本研究中我們表達并純化了SNAP25蛋白，將其作為免疫原免疫小鼠，利用雜交瘤技術制備鼠單抗。經過2輪篩選獲得12株陽性雜交瘤細胞株，經鑒定選擇14號雜交瘤細胞株進行抗體的大量制備，純化后獲得高純度的單克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡BALB/c小鼠購自軍事醫學研究院實驗動物中心；骨髓瘤Sp2/0細胞由本實驗室保存；大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞購自北京天根生化科技有限公司；pET30a-SNAP25質粒由本實驗室構建；弗氏完全、不完全佐劑，TMB顯色液購自Sigma公司；DMEM購自Cellmax公司；HAT、胎牛血清購自Gibco公司；PEG1500購自Roche公司；Ni2+-IDA HP、HiTrap Protein G HP購自GE公司；HRP標記羊抗鼠IgG二抗購自Thermo公司；抗體亞型鑒定試劑盒購自北京博奧龍免疫技術公司；96孔酶標板購自NEST公司。

1.2 制備抗原SNAP25

將構建的重組質粒pET30a-SNAP25轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培養；挑取平板上的單克隆接種至5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，37℃、200 r/min振蕩培養過夜；次日按1∶100接種至200 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，37℃、200 r/min培養至D600nm為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，15℃、200 r/min振蕩培養16 h，誘導重組蛋白表達；4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，菌體沉淀用結合緩沖液（20 mmol/L PB，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪 唑 ，1% TritonX-100，2mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF，pH7.2）重懸，超聲波破碎菌體；4℃、12 000 r/min離心10 min收集上清，上樣至已用結合緩沖液平衡過的Ni2+-IDA親和層析柱，再用含不同濃度咪唑的洗脫緩沖液洗脫目標蛋白，收集各階段的洗脫組分進行SDS-PAGE分析。

1.3 小鼠免疫及效價檢測

選取4只SPF級6～8周齡雌性BALB/c小鼠，編號1～4。初次免疫每只小鼠經皮下注射60 μg SNAP25蛋白。具體地，將240 μg SNAP25蛋白用PBS稀釋后加入等體積弗氏完全佐劑，充分混勻直至形成穩定的油包水型乳劑，在每只小鼠背部選取5個點進行皮下注射，0.2 mL/點；之后每隔2周重復免疫1次（佐劑換為弗氏不完全佐劑），共4次，免疫量為30 μg蛋白/只；第4次免疫7 d后對小鼠進行眼眶取血，全血于室溫靜置30 min，4℃、3000 r/min離心10 min收集血清，間接ELISA法測定血清效價。具體地，用2 μg/mL的SNAP25抗原包被96孔酶標板，100 μL/孔，4℃包被過夜，PBS-T洗3次；用2%脫脂牛奶于37℃封閉2 h，PBS-T洗3次；血清用封閉液按1∶200稀釋作為起始濃度，再按照1∶2梯度稀釋共10個濃度，分別取100 μL加入96孔酶標板，37℃孵育1 h，PBS-T洗3次；HRP標記羊抗鼠IgG二抗按1∶50 000稀釋，取100 μL加入96孔酶標板，37℃孵育1 h，PBS-T洗3次；每孔加入100 μL TMB顯色液，避光顯色5 min，加入終止液，酶標儀讀數。

1.4 細胞融合

對血清效價最高的小鼠通過腹腔注射200 μg SNAP25蛋白進行抗原沖擊，3 d后進行細胞融合。融合當天，將小鼠摘眼球取血（制備血清留作陽性對照）后斷頸處死，在75%酒精中浸泡5 min；無菌條件下分離小鼠脾臟和胸腺，先將胸腺用注射器內芯研碎后加入1 mL HAT，轉移至50 mL無菌離心管，放入培養箱備用；將脾臟充分研磨后過細胞篩，用少量無血清DMEM沖洗后加入50 mL離心管，1500 r/min離心5 min，棄上清，細胞沉淀用DMEM重懸，反復清洗3次后用DMEM調整脾細胞數目為108左右；將生長狀態良好、處于對數生長期的骨髓瘤Sp2/0細胞用DMEM清洗2次，調整細胞數目為107左右（脾細胞∶Sp2/0細胞=10∶1）；將脾細胞和Sp2/0細胞加入50 mL離心管后混勻，1500 r/min離心5 min，小心棄上清，輕彈離心管底部使細胞松散；將離心管置于37℃溫水中，1 min內緩慢加入1 mL PEG1500，邊加邊輕輕搖動，加完后靜置90 s；在1 min內均勻加入1 mL DMDM，然后在2 min內均勻加入4 mL DMDM，800 r/min離心3 min；小心棄上清，用20 mL胎牛血清輕輕重懸細胞沉淀，加入準備好的胸腺細胞，混勻；同時準備30 mL經高壓滅菌的半固體培養基，倒入含胸腺細胞的離心管中，上下顛倒混勻；均勻倒入25個細胞培養皿中，轉移至37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.5 陽性雜交瘤細胞篩選

融合的細胞用半固體培養基篩選培養2周后，挑取細胞培養皿上的單克隆接種到96孔板（板中提前加入胸腺細胞，100 μL/孔），93個克隆/板，共挑取10塊96孔板，置于培養箱中培養；3 d后，利用ELISA對雜交瘤細胞進行第1輪篩選。具體地，將96孔酶標板用2 μg/mL SNAP25抗原包被，100 μL/孔，4℃包被過夜，PBS-T 洗3次；用 2%脫脂牛奶作為封閉液，200 μL/孔，37℃封閉2 h，PBS-T洗3次；將雜交瘤細胞上清作為一抗加入96孔酶標板，100 μL/孔，同時設陰性對照（Sp2/0培養上清）、空白對照（PBS）和陽性對照（陽性血清用PBS按1∶1000稀釋），37℃孵育1 h，PBS-T洗3次；HRP標記羊抗鼠IgG二抗用PBS按1∶20 000稀釋后加入酶標板，100 μL/孔，37℃孵育1 h，PBS-T洗3次；加入TMB顯色液，100 μL/孔，顯色5 min；加入終止液，50 μL/孔，酶標儀讀取D450nm值，記錄保存數據。

對于第1輪篩選得到的陽性雜交瘤細胞，2 d后按照相同方法進行第2輪篩選，2輪篩選后得到的陽性雜交瘤細胞經擴大培養后及時凍存。

1.6 抗體亞型分析

取陽性雜交瘤細胞上清，利用抗體亞型鑒定試劑盒鑒定抗體亞型。

1.7 抗體大量制備及純化

選取2只8～10周齡雌性BALB/c小鼠，腹腔注射0.5 mL滅菌的液體石蠟；1周后取0.5 mL密度為2×106/mL的雜交瘤細胞懸液，通過腹腔注射接種到小鼠腹腔內，誘發小鼠產生腹水；10～14 d后小鼠腹部明顯膨大，用注射器抽取腹水，12 000 r/min離心20 min去除血脂和其他雜質，收集上清加入等體積結合緩沖液混勻，上樣至用結合緩沖液平衡過的HiTrap Protein G親和層析柱，平衡至基線后用洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫組分，利用SDS-PAGE檢測抗體純度。

2 結果

2.1 抗原SNAP25的純化

將重組質粒pET30a-SNAP25轉化大腸桿菌BL21（DE3），在IPTG終濃度為0.1 mmol/L、于15℃誘導16 h的條件下，實現了SNAP25蛋白的可溶性表達，表達量約占全菌蛋白的26%。表達菌pET30a-SNAP25/BL21（DE3）經誘導表達后超聲波破碎，取上清液用Ni2+-IDA親和層析柱純化，用含不同濃度咪唑的洗脫液洗脫，洗脫組分經SDSPAGE分析，在相對分子質量約25 000處可見特異性蛋白條帶（圖1），分子大小與目的蛋白的理論值相符。利用Gelpro32軟件分析，SNAP25蛋白的純度大于90%。

圖1 SNAP25蛋白純化的SDS-PAGE分析

2.2 小鼠血清效價

通過皮下注射SNAP25抗原對4只BALB/c小鼠進行4次免疫，第4次免疫7 d后眼眶取血收集血清，間接ELISA法檢測血清效價，結果1～4號小鼠血清效價依次為6400、3200、3200、1600，1號小鼠血清效價最高，因此選取1號小鼠進行細胞融合實驗。

2.3 陽性雜交瘤細胞篩選

融合后的細胞利用半固體培養基進行篩選培養，挑取細胞單克隆接種至96孔板，培養后取細胞上清利用ELISA對雜交瘤細胞進行第1輪篩選，得到21株陽性雜交瘤細胞，編號1～21。采用相同方法對這21株陽性雜交瘤細胞進行第2輪篩選，結果如圖2，最終得到12株陽性雜交瘤細胞株（D450nm大于陰性對照5倍以上）。其中14號雜交瘤細胞株具有相對較高的抗原結合活性，因此選擇14號雜交瘤細胞株進行抗體的大量制備。

圖2 陽性雜交瘤細胞第2輪篩選

2.4 抗體亞型分析

對篩選得到的12株陽性雜交瘤細胞進行抗體亞型鑒定，確定這12株陽性雜交瘤細胞抗體的重鏈除3株為IgG2型外，其余均為IgG1型；輕鏈除2株為λ鏈外，其余均為κ鏈（表1）。

表1 12株陽性雜交瘤細胞抗體亞型

2.5 抗體純化

用14號雜交瘤細胞株制備小鼠腹水，收集腹水離心取上清，采用HiTrap Protein G親和層析柱純化，SDS-PAGE檢測抗體純度。在相對分子質量約55 000和25 000處可見2條特異性條帶（圖3），分子大小分別與抗體重鏈、輕鏈的理論值相符。利用軟件Gelpro32分析，抗體純度大于90%。

圖3 SNAP25抗體純化的SDS-PAGE分析

3 討論

本研究中我們利用雜交瘤技術制備針對SNAP25的單克隆抗體，以大腸桿菌表達的SNAP25蛋白作為免疫原對4只BALB/c小鼠進行了5次免疫，選取其中血清效價最高的小鼠進行細胞融合實驗，融合的雜交瘤細胞經過2輪篩選，獲得12株陽性雜交瘤細胞株。經ELISA檢測，選擇抗原結合活性較高的14號細胞株，擴大培養后注射到小鼠腹腔內誘發腹水產生，小鼠腹水經過親和純化，最終獲得1株高純度的單克隆抗體。

肉毒毒素是迄今發現的毒性最強的蛋白毒素，在人體中可以引發肉毒中毒。肉毒毒素共有40多種亞型，根據其毒性及抗原性的差異，主要分為A～G共7種血清型。其中A、B、E、F型容易引發人類肉毒中毒，C、D型主要引發動物肉毒中毒，G型則比較少見[7]。肉毒毒素是雙鏈蛋白質，由通過二硫鍵連接的相對分子質量約100 000的重鏈（HC）和約50 000的輕鏈（LC）組成。肉毒毒素的重鏈C端包含受體結合結構域，能夠與位于神經元細胞膜表面的神經節苷脂受體及某些特定蛋白質結合，通過內吞作用將輕鏈運送至胞內[8]。輕鏈是借助于Zn2+的蛋白酶[9]，通過在神經肌肉接頭處切割SNAP25發揮作用。肉毒毒素的多種血清型都可以通過靶向參與神經遞質釋放的胞吐過程的SNAP25蛋白，達到抑制神經遞質釋放的作用。例如，A型肉毒毒素（BoNT/A）的輕鏈在氨基酸殘基Gln197和Arg198之間切割SNAP25；E型肉毒毒素（BoNT/E）的輕鏈在氨基酸殘基Arg180和Ile181之間切割SNAP25；C1型肉毒毒素（BoNT/C1）的輕鏈在氨基酸殘基Arg198和Ala199之間切割SNAP25[10]。BoNT/A的輕鏈切割SNAP251-206后形成產物SNAP251-197，同時暴露出原先包埋于C端α螺旋內部的八肽抗原表位[11]。通過檢測此八肽抗原，可以進行肉毒毒素活性的定性或定量測定。

我們制備了針對SNAP25的單克隆抗體，目前正在制備針對SNAP25的肉毒毒素切割產物的特異性抗體，可以將二者結合通過夾心ELISA檢測肉毒毒素對SNAP25的切割活性，取代傳統上檢測肉毒毒素活性的小鼠生物測定法。此外，由于SNAP25對于調節神經遞質釋放及軸突生長具有重要作用，本研究制備的抗體可望用于人或動物大腦等組織中SNAP25表達水平的檢測，有助于推動SNAP25在神經傳導中的機制研究。