miR-143-3p通過靶向TAK1抑制肺癌增殖和侵襲

廉亮亮，齊書山，袁洪志

北京市房山區良鄉醫院 胸心血管外科，北京 102400

2018年全球癌癥統計報告表明，肺癌發病率和死亡率均居首位[1]。腫瘤異質性和預后不良是導致肺癌患者高死亡率的主要原因，近幾年雖然肺癌的診斷治療取得了實質性進展，但肺癌的整體5年生存率仍不超過18%[2]。因此，探究肺癌發生發展的分子機制，為肺癌提供更新的治療策略是十分必要的。

微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類包含19～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA，可以通過與靶基因的3'非翻譯區（3'UTR）相互作用調節基因表達[3]。據報道，miRNA可以在包括肺癌在內的不同疾病中，作為致癌基因或腫瘤抑制因子[4]，如miR-17-92[5]、miR-21[6]、miR-548a-5p[7]、miR-425-5p[8]促進肺腫瘤發生，而 miR-19a-3p[9]、miR-33a-5p[10]、miR-466[11]和 miR-577[12]充當腫瘤抑制因子。

研究顯示，miR-143-3p通過靶向調控基因表達影響癌癥的發生發展，如在膀胱癌和結直腸癌中，miR-143-3p通過靶向細胞外信號調節激酶5/蛋白激酶 B（ERK5/Akt）[13]或者通過抑制 KRAS 翻譯[14]來抑制腫瘤發展；miR-143-3p通過靶向調控整合素α6（integrin alpha 6，ITGA6）和錨蛋白重復及PH結構域3（ankyrin repeat and PH domain 3，ASAP3）表達抑制結直腸癌轉移[15]。我們檢測了miR-143-3p在肺癌細胞中的表達情況以及對肺癌細胞功能的影響，并探究了miR-143-3p對轉化生長因子β激活激酶1（transforming growth factor beta-activated kinase 1，TAK1）表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2018-03-14～2019-03-14在北京市房山區良鄉醫院普外科手術治療的10例肺癌患者，每例分別取肺癌組織和癌旁組織；人肺癌細胞系HCC27、H1975、A549，人正常肺上皮細胞 BEAS-2B購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心；miR-143-3p mimics和miR-143-3p抑制劑anti-miR-143-3p購自百奧邁科生物技術有限公司；轉染試劑LipofectAMINE 2000購自Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒和SYBR Green染料購自TaKaRa公司；All-in-one miRNA qRT-PCR檢測試劑盒和miR-143-3p、U6的引物購自GeneCopoeia公司；凝膠成像儀和化學顯色液購自Bio-Rad公司；TAK1抗體、GAPDH抗體和HRP標記的二抗購自Abcam公司。

1.2 miR-143-3p腫瘤組織表達分析

利用starBase在線分析平臺挖掘來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的肺癌miR-143-3p表達譜。

1.3 總RNA提取和實時熒光定量PCR

TRIzol法提取細胞總RNA。用All-in-one miRNA qRT-PCR檢測試劑盒檢測miR-143-3p的表達，以U6為內參。用2 μg總RNA進行反轉錄，qPCR檢測目的基因的相對含量，并以GAPDH為內參，通過 CT（2-ΔΔCt）方法將基因表達標準化。各基因qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR基因引物序列

1.4 細胞培養和轉染

細胞在37℃、5%CO2條件下用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養。用LipofectAMINE 2000轉染試劑轉染細胞，取miR-143-3p mimics和anti-miR-143-3p各50 nmol/L轉染細胞，分為陰性對照組（NC）、轉染組（miR-143-3p mimics）、轉染組（miR-143-3p mimics+anti-miR-143-3p）。

1.5 CCK-8實驗

CCK-8法檢測3個處理組肺癌細胞的活力。取對數生長期細胞制備單細胞懸液，每孔接種2×103細胞，在培養 1、2、3 d后，每孔分別加入 10 μL CCK-8，溫育4 h后測定每孔的D450nm值，以時間為橫坐標、D450nm值為縱坐標繪制曲線。

1.6 細胞遷移實驗

將Transwell小室放入24孔板中，并在孔板中加入500 μL含10%胎牛血清的培養基作為下液，繼續培養24 h后取出小室。用甲醇固定15 min，DPAI染色10 min，PBS清洗后在熒光顯微鏡下觀察，拍照，計數。

1.7 細胞侵襲實驗

取出凍存的Matrigel基質膠，4℃過夜融化，取適量預冷的無血清培養基按1∶5稀釋Matrigel膠，混勻后加入Transwell小室中。其余步驟同Transwell遷移實驗。

1.8 蛋白質印跡法檢測TAK1蛋白表達水平

取適量RIPA蛋白裂解液在冰上裂解收集的細胞，離心收集上清，測定蛋白質濃度，制備蛋白上樣液，用10%SDS-PAGE分離蛋白。電泳結束后，恒流電轉至PDVF膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉后，將膜與TAK1抗體、GAPDH抗體一起孵育。以HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗，化學顯色液顯色后，放至凝膠圖像分析儀中成像。

1.9 統計分析

數據用GraphPad Prism 7進行統計學分析。計量數據以x±s表示，組間數據采用單因素方差分析，兩兩多重比較采用LSD檢驗方法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-143-3p在肺癌組織中的表達

通過starBase對TCGA數據庫中有關miR-143-3p在肺癌中的表達數據進行分析，數據中包括512例肺腺癌和475例肺鱗癌，相應癌旁正常組織作為對照樣本。結果顯示，無論在肺腺癌組織中還是在肺鱗癌組織中，miR-143-3p的表達量均明顯低于相應對照組織中的表達；此外，還檢測了miR-143-3p在10例肺癌患者中的表達，同樣發現miR-143-3p在腫瘤組織中的表達顯著低于癌旁組織中的表達。這說明miR-143-3p可能在肺癌中發揮著重要作用。結果見圖1。

圖1 miR-143-3p在肺癌組織中的表達特點（**P＜0.01）

2.2 miR-143-3p在肺癌細胞系中的表達

qRT-PCR檢測3個肺癌細胞系中miR-143-3p的相對表達量，結果見圖2，miR-143-3p在肺癌細胞中的表達量顯著低于在正常細胞BEAS-2B中的表達，這與miR-143-3p在肺癌組織中的表達情況一致。

2.3 miR-143-3p對肺癌細胞增殖活力的影響

選取肺癌細胞H1975、A549檢測miR-143-3p表達對肺癌細胞增殖活力的影響，結果見圖3。NC對照組和miR-143-3p+anti-miR-143-3p組肺癌細胞增殖活力均顯著高于miR-143-3p組，說明miR-143-3p抑制肺癌細胞的增殖活力。

圖2 qRT-PCR檢測miR-143-3p在肺癌細胞系中的表達（*P＜0.05）

圖3 CCK-8法測定miR-143-3p表達對肺癌細胞H1975、A549活力的影響（*P＜0.05）

2.4 miR-143-3p對肺癌細胞遷移和侵襲的影響

采用Transwell法進一步探究miR-143-3p過表達對肺癌細胞的遷移和侵襲的影響，結果見圖4。在2種肺癌細胞系中，miR-143-3p組的遷移和侵襲相對活力顯著低于NC對照組和miR-143-3p+anti-miR-143-3p組，而NC對照組和miR-143-3p+anti-miR-143-3p組間沒有顯著差異，說明miR-143-3p過表達抑制肺癌細胞的侵襲和遷移。

2.5 miR-143-3p在肺癌細胞中對ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1表達的影響

已有研究顯示，miR-143-3p可以靶向調控ITGA6、ASAP3抑制結直腸癌的轉移[15]，也可以靶向調控黑色素瘤相關抗原A9（melanoma-associated antigen-A9，MAGE-A9）抑制喉部鱗狀細胞癌增殖、遷移和侵襲[16]，還可以靶向調控TAK1表達抑制卵巢癌的進展[17]。因此，我們檢測了在肺癌細胞系 H1975、A549中 miR-143-3p對 ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1表達的影響。從圖5可以看出，miR-143-3p能夠使 ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1的表達均降低，但其中對TAK1表達的影響最為顯著。

2.6 miR-143-3p在肺癌細胞中對TAK1蛋白表達的影響

圖5顯示，miR-143-3p對TAK1 mRNA表達影響最為顯著，因此相應檢測了miR-143-3p對TAK1蛋白表達的影響，結果見圖6。與對照相比，miR-143-3p過表達顯著降低了TAK1蛋白的表達，但miR-143-3p抑制劑處理后，TAK1蛋白表達水平又恢復至對照水平。該結果說明在肺癌細胞中miR-143-3p可以抑制TAK1的表達。

3 討論

肺癌的發病率和死亡率均居全球癌癥發病和死亡的首位，而我國肺癌發病數和死亡數分別占全球的37%、39.2%[18]。雖然近年在肺癌診斷和治療方面取得了一些進展，但肺癌的預后仍然不理想。探究肺癌發生發展機制，為肺癌的診斷和治療提供新的思路和靶標是十分必要的。

本研究表明，肺癌細胞中的miR-143-3p表達水平低于肺正常上皮細胞，同時我們通過starBase分析TCGA數據庫中miR-143-3p在肺癌組織中的表達和檢測肺癌患者組織樣品發現，miR-143-3p在肺癌組織中的表達水平也低于正常肺組織，與細胞中的檢測結果一致。這提示miR-143-3p可能在肺癌進展過程中發揮重要作用。為了進一步探究miR-143-3p對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，我們通過CCK-8實驗、Transwell遷移和侵襲實驗發現，miR-143-3p過表達抑制了肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，表明miR-143-3p可以作為腫瘤抑制因子，這為肺癌腫瘤治療提供了新的思路。

為了探討miR-143-3p抑制肺癌細胞進展的機制，我們通過qRT-PCR檢測ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1的表達，發現miR-143-3p過表達后，肺癌細胞中 ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1的mRNA表達水平均降低，但其中對TAK1表達的影響最顯著。進一步采用蛋白免疫印跡檢測，發現miR-143-3p同樣也顯著抑制TAK1蛋白表達水平。TAK1屬于絲裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）家族，參與控制各種細胞系統中p38MAPK和JNK的激活[19]。TAK1是內皮細胞凋亡和轉移的關鍵調節因子[20]，TAK1的缺失會導致JNK和NF-κB信號傳導失活，后兩者都在細胞存活和增殖中起關鍵作用[21]。因此，miR-143-3p可能通過調控TAK1的表達來影響肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

圖4 Transwell法測定miR-143-3p表達對肺癌細胞H1975、A549侵襲/遷移的影響（*P＜0.05）

圖5 qRT-PCR檢測miR-143-3p在肺癌細胞H1975、A549中對ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1 mRNA表達的影響

圖6 Western印跡檢測肺癌細胞中miR-143-3p對TAK1蛋白表達水平的影響

綜上，miR-143-3p在腫瘤細胞中低表達，可以作為腫瘤抑制因子，通過調控TAK1的表達來影響腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。miR-143-3p為改善肺癌預后提供了新的思路，但miR-143-3p在肺癌進展中詳細的分子作用機制和信號通路仍須進一步探究。