分子與血清學(xué)檢測(cè)確診2017年西非塞拉利昂1例猴痘病毒感染病例

宋敬東趙 莉張 益夏連續(xù)祝令偉任 嬌王文玲武桂珍田厚文譚文杰

猴痘是由猴痘病毒感染引起的急性人獸共患傳染病。猴痘病毒是一種基因組長(zhǎng)達(dá)200 kbp 左右的DNA病毒，屬于痘病毒科正痘病毒屬，同一屬的病毒還包括天花病毒、牛痘病毒等[1]。猴痘病毒最早是1958年在哥本哈根的實(shí)驗(yàn)猴體內(nèi)分離得到[2]，是一種重要的動(dòng)物源性感染病原。人感染猴痘病毒后臨床癥狀主要表現(xiàn)為類(lèi)似天花感染的早期發(fā)熱類(lèi)癥狀，包括發(fā)熱、頭疼、乏力和皮膚出痘等。與天花感染者不同的是，猴痘感染病人有典型的淋巴結(jié)相關(guān)疾病，可以通過(guò)接觸感染者傷口和呼吸道傳播[3-4]。19世紀(jì)70年代以來(lái)，隨著天花病毒被消滅，已經(jīng)有不少猴痘病毒感染人類(lèi)的病例報(bào)道。首個(gè)猴痘病毒感染人的病例是1971年民主剛果共和國(guó)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的，目前猴痘病例主要分布在非洲中、西部熱帶雨林地帶的國(guó)家。2003年，由于進(jìn)口了西非地區(qū)加納的野生動(dòng)物，美國(guó)有47例猴痘病毒感染病例的報(bào)道[6]。近幾年在非洲，猴痘病毒感染病例常有報(bào)道，剛果(金)2013報(bào)道 104例病例，50例被確診，10例死亡。2016年9月4日至10月7日，WHO在中非報(bào)道了26例的確診病例。從2017年9月4日至12月9日，西非的尼日尼亞有172例疑似病例，其中有61例確診病例(http://www.who.int)。

2017年3月16日，在塞拉利昂南部普杰洪省，一位35歲的獵人出現(xiàn)發(fā)燒、身體疼痛、吞咽困難和淋巴結(jié)腫大。3月17日皮膚出痘，進(jìn)入當(dāng)?shù)蒯t(yī)院治療。分別于3月28日(出現(xiàn)癥狀后12 d)和5月10日(出現(xiàn)癥狀后55 d)，采集病人的血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。本文對(duì)該病人的血清樣本分別進(jìn)行核酸和血清學(xué)檢測(cè)，結(jié)合臨床學(xué)特征和病人野生動(dòng)物接觸史，確診該病人為猴痘病毒感染。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1送檢樣本 疑似病人感染后第12 d、55 d血清，由塞拉利昂衛(wèi)生部采集并提供相關(guān)流行病學(xué)信息，樣本按不明原因發(fā)熱出疹送中塞友好生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行Zika與Ebola病毒檢測(cè)(檢測(cè)結(jié)果皆為陰性)。樣本滅活及核酸提取皆在塞拉利昂-中國(guó)友好生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室操作。

1.1.2引物、探針與多肽 猴痘特異性引物是針對(duì)MPXV F3L 基因設(shè)計(jì)[7](D14L)，F(xiàn)3L-F290:5′-CTCATTGATTTTTCGCGGGATA-3′，F(xiàn)3L-R396:5′-GACGATACTCCTCCTCGTTGGT-3′，熒光標(biāo)記探針為F3Lp333S-MGB：5′-FAM-CATCAGAATCTGTAGGCCGT MGBNFQ-3′，由美國(guó)Applied Biosystems Inc合成。DNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，TaqMan Universal PCR Master Mix 購(gòu)自Applied Biosystems Inc公司。猴痘特異性多肽(B21R-179-BSA, B21R-185-BSA)參考2005年文獻(xiàn)[8]，由中科亞光生物科技公司合成，純度大于90%。

1.1.3其他實(shí)驗(yàn)材料 滅活的痘苗病毒由本科室利用143TK-細(xì)胞(ATCC)擴(kuò)增獲得，為痘苗病毒天壇株(TK+)來(lái)自衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所，批號(hào)7601。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG、IgM抗體購(gòu)自碧云天。96孔板、封閉液、樣本稀釋液、顯色液和終止液均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。痘苗病毒陽(yáng)性血清(痘苗病毒天壇株實(shí)驗(yàn)室感染者恢復(fù)期血清)和陰性血清(正常成年人體檢血清)由本科室提供和保存。

1.2 方 法

1.2.1利用real-time PCR對(duì)猴痘病毒核酸特異性檢測(cè)[7]按照QIAamp DNA Mini kit (Qiagen, USA)的說(shuō)明書(shū)從200 μL 病毒血清中提取DNA。提取好的基因組放置于-70 ℃冰箱保存。實(shí)時(shí)定量 PCR在 Bio-rad公司的CFX96機(jī)器上進(jìn)行，程序如下:95 ℃,10 min，95 ℃，30 s，60 ℃，60 s，40個(gè)循環(huán)。 每個(gè)反應(yīng)重復(fù)2次，孔板對(duì)照的模板為水，陽(yáng)性對(duì)照模板為含有該段基因的質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)。

1.2.2正痘病毒IgG和IgM抗體檢測(cè)[8]用100 μL含有滅活的痘苗病毒的包被液(106PFU)包被96孔ELISA板，4 ℃過(guò)夜。以含有0.05% Tween、5%脫脂奶粉、2% BSA和2%山羊血清的PBS封閉ELISA板。將病人血清樣本以1∶50～1∶6 400進(jìn)行倍比稀釋后，按照每孔100 μL 加入ELISA板中，37 ℃反應(yīng)1 h。 PBST洗板拍干后，加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗人IgG或者IgM抗體，37 ℃反應(yīng)1 h。PBST洗板拍干后加入TMB底物顯色液，反應(yīng)5 min后加入終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)板中每孔液體450 nm 處的吸光度值。將陰性對(duì)照的平均值的2.1倍定義為cutoff值，OD值大于或等于cutoff值判定為陽(yáng)性。

1.2.3猴痘病毒IgG和IgM抗體檢測(cè)[8]用包被液稀釋猴痘特異性多肽(B21R-179-BSA, B21R-185-BSA)至500 ng/mL，100 μL/孔包被，4 ℃過(guò)夜。剩余步驟同正痘病毒IgG和IgM抗體檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1流行病學(xué)史 2017年3月16日，一位塞拉利昂南部普杰洪省的35歲獵人出現(xiàn)發(fā)燒、身體疼痛、吞咽困難和淋巴結(jié)腫大。第2 d，皮膚出現(xiàn)痘狀水皰。在出現(xiàn)癥狀的10 d前，該病人曾去野外狩獵，并食用捕獲野生動(dòng)物。經(jīng)過(guò)住院治療后，病人逐漸康復(fù)。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院將16位曾有病人接觸史的居民，進(jìn)行隔離21 d觀(guān)察，沒(méi)有疑似感染癥狀出現(xiàn)。

2.2核酸檢測(cè) 于3月28日(SL-D12：出現(xiàn)癥狀后12 d)與5月10日(SL-D55：出現(xiàn)癥狀后55 d)，分別采集病人的血清進(jìn)行核酸提取以及猴痘特異性Real-time PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示，SL-D12的Ct值為35左右(3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果)，SL-D55的檢測(cè)結(jié)果為陰性。

2.3正痘病毒IgG和IgM檢測(cè) 正痘病毒IgM檢測(cè)結(jié)果，SL-D12血清進(jìn)行50～200倍稀釋后，IgM檢測(cè)為陽(yáng)性；SL-D55樣本，50倍稀釋的IgM為陽(yáng)性；而正痘病毒IgG檢測(cè)結(jié)果，50～800倍稀釋的SL-D12血清檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，而50～400倍稀釋的SL-D55血清檢測(cè)后均為陽(yáng)性 (表1)。

2.4猴痘病毒IgG檢測(cè) 為了進(jìn)一步判斷是否為猴痘病毒特異性IgG，我們以猴痘特異性多肽作為抗原包被ELISA微孔板，檢測(cè)猴痘特異性IgG水平。50～800倍稀釋的SL-D12血清，猴痘IgG結(jié)果為陽(yáng)性，而SL-D55血清稀釋至3 200倍，仍為陽(yáng)性，提示55 d較22 d抗體滴度有4倍升高(表1)。

注：1.陽(yáng)性對(duì)照；2. 樣本SL-D12；3.樣本SL-D55；每組均設(shè)置復(fù)孔圖1 疑似感染者血清中猴痘病毒核酸檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Results of nucleic acid detection to Monkeypox virus of suspected patient

表1 疑似感染者血清ELISA檢測(cè)結(jié)果
Tab.1 ELISA results of sera samples from suspected patient

血清稀釋倍數(shù)痘苗病毒 IgM 痘苗病毒 IgG 猴痘病毒 IgG SL-D12 SL-D55SL-D12SL-D55SL-D12SL-D55505.222.684.834.7711.4314.261005.211.844.433.96 9.4113.572002.801.293.883.74 6.9711.864001.680.893.682.90 4.5911.048001.350.522.741.59 2.629.041 6000.760.581.520.57 1.846.463 200NDNDNDNDND2.816 400NDNDNDNDND1.34

ND: 未檢測(cè)。

3 討 論

猴痘病例主要分布在非洲中、西部熱帶雨林地帶的國(guó)家，美國(guó)2003年發(fā)生猴痘流行，共發(fā)現(xiàn)72例疑似病例，47例經(jīng)實(shí)驗(yàn)室證實(shí)[6]，大部分病例可能是由于接觸了來(lái)自動(dòng)物經(jīng)銷(xiāo)商的進(jìn)口非洲土撥鼠而感染的動(dòng)物引起。這是首次發(fā)生在非洲大陸之外的猴痘流行，說(shuō)明在全球一體的貿(mào)易和旅游時(shí)代，一些罕見(jiàn)的或外來(lái)的病原體可以跨越自然疫源區(qū)的地理界限而迅速蔓延。我國(guó)目前雖無(wú)猴痘輸入性病例，但在中西非的勞務(wù)及援外人員數(shù)以千計(jì)，且經(jīng)常往返，隨時(shí)有病例輸入的可能性。因此，我國(guó)應(yīng)該加強(qiáng)痘病毒鑒別診斷新技術(shù)儲(chǔ)備與研發(fā)，為應(yīng)對(duì)可能突發(fā)出現(xiàn)的猴痘病毒或其他危害嚴(yán)重的正痘病毒傳入與感染流行提供技術(shù)支持。

塞拉利昂是一個(gè)有超過(guò)七百萬(wàn)人口的西非國(guó)家，1970年，塞拉利昂出現(xiàn)過(guò)1例的猴痘感染確診病例，之后數(shù)十年沒(méi)有病例的報(bào)道[9]。有研究對(duì)西非報(bào)道的猴痘病毒基因組進(jìn)行測(cè)序、進(jìn)化樹(shù)分析及地理分布模型的預(yù)測(cè)顯示，塞拉利昂的南部適合猴痘病毒的傳播[10]。1967-1968年起，為了消滅天花，在當(dāng)?shù)叵破鸫笠?guī)模的疫苗接種運(yùn)動(dòng)，疫苗接種率達(dá)到了80%[11]。而疫苗的接種，會(huì)在接種者體內(nèi)產(chǎn)生抗正痘病毒的保護(hù)性抗體，持續(xù)數(shù)十年之久[12]。有文章通過(guò)血清學(xué)調(diào)查，報(bào)道了在塞拉利昂東南部人群中存在正痘病毒IgG和IgM陽(yáng)性的血清，其中血清抗體陽(yáng)性多為出生在天花疫苗接種之后，提示該地區(qū)存在正痘病毒區(qū)域流行情況[13]。

由于當(dāng)?shù)貧夂蜓谉幔?dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)水平和基礎(chǔ)設(shè)施較差，樣本的儲(chǔ)存和運(yùn)輸存在著困難，目前中塞友好生物安全實(shí)驗(yàn)室也沒(méi)有條件進(jìn)行病毒分離實(shí)驗(yàn)。利用二代測(cè)序技術(shù)研究猴痘病毒基因組已經(jīng)成為一種重要的實(shí)驗(yàn)方法，猴痘病毒主要存在西非株和剛果株2個(gè)不同的基因型[14]。由于本研究得到的樣本質(zhì)量較差，通過(guò)二代測(cè)序，沒(méi)能獲得完整的猴痘病毒基因組全序列。下一步將利用特異性PCR方法，對(duì)在進(jìn)化樹(shù)上保守基因組區(qū)進(jìn)行序列擴(kuò)增克隆分析，研究其進(jìn)化情況。

猴痘病毒特異性IgG和IgM 血清學(xué)診斷方法一直存在困難，特別是cutoff值的確定[15]。本研究利用痘苗病毒作為抗原，進(jìn)行正痘病毒IgG和IgM檢測(cè)，結(jié)果顯示，二者均為陽(yáng)性，而這是否因?yàn)榛颊咴?jīng)接種過(guò)天花病毒，需要進(jìn)一步研究。猴痘病毒特異性多肽作為抗原包被，確定是否存在猴痘病毒特異性IgG和IgM，結(jié)果顯示在急性期(SL-D12)和恢復(fù)期(SL-D55)血清中，猴痘病毒特異性IgG存在超過(guò)4倍升高，且有良好的重復(fù)性(表1)。而猴痘病毒特異性IgM的方法重復(fù)性較差，這與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的類(lèi)似。由于國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)猴痘感染病例，本實(shí)驗(yàn)室建立的方法也存在不足之處，下一步需要更多的樣本進(jìn)行驗(yàn)證。

本文首次應(yīng)用猴痘病毒核酸檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)的方法確診了2017年西非塞拉利昂一例臨床疑似病人為猴痘病毒感染。同時(shí)，也采用猴痘病人感染樣本對(duì)本實(shí)驗(yàn)建立的猴痘病毒檢測(cè)方法進(jìn)行了應(yīng)用驗(yàn)證，下一步將繼續(xù)密切關(guān)注該地區(qū)猴痘病毒感染情況，不斷優(yōu)化完善猴痘病毒快速診斷與鑒定技術(shù)。