MTBDRplus技術快速檢測結核分枝桿菌耐多藥的臨床應用評價

耐藥結核病的發生和流行成為結核病控制的重要障礙和急待解決的世界性嚴重公共衛生問題。2007年全國結核病耐藥性基線調查報告顯示，我國肺結核的耐多藥率為8.32%，據此估計，我國耐多藥結核病(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)患者達12萬例，約占全球1/4～1/3，居全球第2位[1]。傳統的結核病藥敏檢測方法至少需要2～3月的時間，遠不能滿足臨床早期診斷的需要，早期耐藥性診斷技術的突破是當前控制耐藥結核病的關鍵。

1 材料與方法

1.1材料 本研究共調查了2010-2016年福州市各區縣疾控中心收治的262例涂陽肺結核患者，分離培養出262株分枝桿菌，經傳統PNB和TCH生長試驗鑒定246株為結核分枝桿菌，16株為非結核分枝桿菌(NTM)。標準菌株H37 RV由國家參比室惠贈。

1.2培養、菌種鑒定和耐藥檢測方法 按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[5]規定進行分枝桿菌分離培養、菌種初步鑒定，采用WHO/IUATLD《結核病耐藥監測指南》[6]推薦的比例法對INH和RIF進行耐藥檢測。

1.3 MTBDRplus技術檢測

1.3.1提取DNA 取1～2個菌落懸于300 μL無菌水中，振蕩混勻， 95 ℃加熱滅活20 min，超聲波裂解15 min。12 000 g離心5 min，取5 μL上清液作為DNA模板用于PCR擴增。

1.3.2擴增 擴增程序為：95 ℃ 15 min，1個循環；95 ℃ 30 s、58 ℃ 2 min，10個循環；95 ℃ 25 s、53 ℃ 40 s、 70 ℃ 40 s，30個循環；70 ℃ 8 min，1個循環。

1.3.3雜交 根據Geno Type MTBDRplus assay試劑盒說明書進行操作。將PCR擴增產物和變性裂解液DEN 20 μL混勻加入雜交反應板，孵育5 min。在全自動雜交儀GT-BLOT48上根據廠家設定的步驟進行操作。雜交后，將試紙條取出置于吸水紙上干燥，然后粘貼在判讀表上。

1.3.4判讀 MTBDRplus雜交試紙條可分為4個區，27個反應條帶(見圖1)。第1區為對照質控帶，有3個質控帶，分別是CC帶，AC帶和TUB帶。CC帶(標記物質控)反映探針試條上標記物結合并與定位反應的有效性，AC帶(擴增質控)用于確認PCR擴增反應是否成功，TUB帶用于確認結核分枝桿菌復合群；第2-4區為耐藥基因探針區：第2區是與RIF耐藥相關的rpoB基因探針組，第3、4區分別是與INH耐藥相關的katG和inhA基因探針組。判讀時，試紙條上所有野生條帶顯色不顯色為敏感菌株；野生條帶有缺失，突變條帶無論是否顯色均判為耐藥。

1.3.5統計分析 應用SPSS16.0軟件進行數據處理，對兩種方法在結核分枝桿菌耐藥檢測中的比較采用配對四格表資料的卡方檢驗，P<0.05差異有統計學意義。采用Kappa值對兩種方法檢測結果一致性進行評價(Kappa值≥0.75為一致性較好，Kappa值在0.4～0.75為一致性一般，Kappa值≤0.4時為一致性差)，利用陽性預測值和陰性預測值對檢測方法應用價值進行評價。

2 結 果

2.1MTBDRplus技術檢測NTM和結核分枝桿菌菌株結果 246株結核分枝桿菌TUB條帶均顯陽性，表明是結核分枝桿菌復合群(見圖1編號2-13和15的試紙條)，與PNB和TCH生長試驗鑒定結果100%符合；16株非結核分枝桿菌TUB條帶缺失，表明未檢出結核分枝桿菌復合群(見圖1編號14的試紙條)，與PNB和TCH生長試驗鑒定結果100%符合。利用MTBDRplus 技術可以很好的區分NTM和結核分枝桿菌。

注：N，陰性對照；1，結核分枝桿菌H37Rv；2-15，分枝桿菌臨床分離株。圖1 GenoType MTBDRplus 技術雜交結果Fig.1 Hybridization assay results of GenoType MTBDRplus

2.2MTBDRplus技術檢測RIF和INH耐藥性結果 在本次研究中，利用傳統羅氏藥敏技術檢測246株結核分枝桿菌，單耐RIF的菌株共計12株，單耐INH的菌株共計18株，耐多藥菌株共計8株，全敏感菌株共計224株。

以傳統羅氏藥敏為金標準，MTBDRplus檢測RIF耐藥性的靈敏度和特異度分別為91.7%和99.6%，陽性預測值和陰性預測值分別為91.7%和99.6%，如表1所示。傳統羅氏藥敏方法和MTBDRplus技術檢測RIF的耐藥率均為4.9%，在福州地區用這兩種方法檢測RIF耐藥比較差異無統計學意義(χ2=0.500，P=0.48>0.05)，兩種方法結果一致性較好(Kappa=0.912)。

以傳統羅氏藥敏為金標準，MTBDRplus檢測INH耐藥性的靈敏度和特異度分別為83.3%和95.2%，陽性預測值和陰性預測值分別為57.7%和98.6%，見表1。傳統羅氏藥敏方法檢測INH的耐藥率為7.3%，MTBDRplus技術檢測INH耐藥率為10.6%，在福州地區用這兩種方法檢測INH耐藥比較差異無統計學意義(χ2=3.500，P=0.061>0.05)，兩種方法結果一致性一般(Kappa=0.652)。

表1 MTBDRplus檢測結果與羅氏藥敏結果比較
Tab.1 Comparison the results of MTBDRplus test with those of Lwenstein-Jensen culture plus drug susceptibility

羅氏藥敏結果MTBDRplus結果RIFINH耐藥敏感耐藥敏感耐藥1111511敏感12333217合計1223418228

2.3MTBDRplus技術檢測結核分枝桿菌臨床分離株katG和inhA基因突變 以傳統羅氏藥敏為金標準，MTBDRplus技術檢測INHkatG耐藥基因突變靈敏度和特異度分別為77.8%和99.6%，陽性預測值和陰性預測值分別為93.3%和98.3%，見表2。傳統羅氏藥敏方法檢測INH的耐藥率為7.3%，MTBDRplus技術檢測katG耐藥基因突變率為10.6%，在福州地區用這兩種方法檢測INH耐藥比較差異無統計學意義(χ2=0.800，P=0.371>0.05)，兩種方法結果一致性較好(Kappa=0.838)。

以傳統羅氏藥敏為金標準，MTBDRplus技術檢測INHinhA耐藥基因突變靈敏度和特異度分別11.1%和95.6%，陽性預測值和陰性預測值分別為16.7%和93.2%，見表2。傳統羅氏藥敏方法檢測INH的耐藥率為7.3%，MTBDRplus技術檢測inhA耐藥基因突變率為4.9%。在福州地區用這兩種方法檢測INH耐藥比較差異無統計學意義(χ2=0.962，P=0.327>0.05)，兩種方法診斷結果一致性較差(Kappa=0.079)。

表2 MTBDRplus檢測katG和inhA基因突變引起耐藥與羅氏藥敏結果比較
Tab.2 Comparison the MTBDRplus detection results ofkatGandinhAgene mutation caused drug resistance with those of Lwenstein-Jensen culture plus drug sensitivity

羅氏藥敏結果MTBDRplus結果katGinhA耐藥敏感耐藥敏感耐藥141210敏感422716218合計1822818228

2.4MTBDRplus技術檢測rpoB基因突變區域分布情況 在12例rpoB基因存在突變的結核分枝桿菌中，7例(58.3%)存在rpoB基因S531L突變，其中1例(8.3%)rpoB基因野生型WT2和WT7同時缺失，提示存在rpoB基因511和526兩個位點突變；1例(8.3%)rpoB基因野生型WT3和WT4同時缺失，提示存在D516Y或515缺失；各有1例(8.3%)存在rpoB基因526位點突變、531位點突變和H526D突變，見表3。在6例耐多藥結核分枝桿菌中，3例(50%)存在rpoB基因S531L突變。

表3 MTBDRplus技術檢測rpoB基因突變區域分布
Tab.3 Detection of mutation site distribution inrpoBgene by MTBDRplus

MTBDRplus 檢測分析菌株數rpoB突變位點結果(%)△WT2 △WT7511和526突變RIFr1(8.3)△WT8 MUT3S531LRIFr6(50)RIFs1(8.3)△WT7526突變RIFr1(8.3)△WT3 △WT4D516Y或515缺失RIFr1(8.3)△WT8531突變RIFr1(8.3)△WT7 MUT2BH526DRIFr1(8.3)合計RIFr /RIFs12

注：WT是野生探針；MUT是突變探針；RIFr是利福平耐藥；RIFs是利福平敏感；△是缺失。

2.5MTBDRplus技術檢測katG和inhA基因突變區域分布情況 26例katG和inhA基因存在突變的結核分枝桿菌中， 57.7%(15/26)存在katG基因315突變，這些315位點突變菌種93.3%(14/15)均為INH耐藥菌株；42.3%(11/26)菌種存在inhA基因C15T位點突變，這些C15T位點突變菌株僅9.1%(1/11)為INH耐藥菌株；有1例菌株同時存在katG和inhA基因突變，見表4。

表4 MTBDRplus技術檢測katG和inhA基因突變區域分布
Tab.4 Detection of mutation site distribution ofkatGandinhAby MTBDRplus

MTBDRplus 檢測分析菌株數katGinhA突變位點結果(%)△WT mut1WTS315T1INHr10(38.5)mut1WTS315T1INHr2(7.7)mut1mut3AS315T1 T8CINHr1(3.8)△WTWTS315TINHs1(3.8)△WT mut2WTS315T2INHr1(3.8)WT△WT1 mut1C15TINHs10(38.5)WT△WT1 mut1C15TINHr1(3.8)合計INHr /INHs26

注：WT是野生探針；mut是突變探針；INHr是異煙肼耐藥；INHs是異煙肼敏感；△是缺失

3 討 論

結核病是我國政策規定的重大傳染病之一，由于藥物的不恰當使用耐藥結核病患病率急劇上升，而耐藥結核分枝桿菌的實驗室快速檢測方法的使用對控制耐藥結核病的傳播具有重要意義。MTBDRplus技術是近年來發展起來基于PCR擴增和雜交的方法，用于檢測特定基因的堿基突變，從而診斷結核分枝桿菌的耐藥性。其檢測相比培養表型分析具有明顯的時間優勢，可同時完成對RIF和INH耐藥性的快速檢測，操作簡單，結果清晰可見[7]。但是，MTBDRplus技術在不同地區對RIF和INH耐藥檢測敏感度不同，尤其是對耐INH菌株的靈敏度差異較大[4]。

北京和上海地區已經對MTBDRplus技術進行了評價，其對RIF和INH的敏感性分別為80.65%～98.0%和72.73%～86.5%[2-3,7]。國際上也有一些研究對MTBDRplus技術進行臨床使用的評價。Causse[8]的研究結果顯示，與傳統的羅氏藥敏方法相比，MTBDRplus技術檢測RIF和INH的敏感度分別達100%和94.59%。可見，在不同國家和地區使用MTBDRplus技術檢測耐多藥結核分枝桿菌差異較大，這可能是由于耐藥基因突變位點因國家和地區而異[9-10]。因此，在某個地區使用MTBDRplus技術進行臨床檢測耐多藥結核分枝桿菌前很有必要進行臨床應用評估。

本研究利用MTBDRplus技術快速檢測246例臨床涂陽肺結核分離株對RIF和INH的耐藥性。與傳統羅氏藥敏結果比較，MTBDRplus技術檢測RIF和INH的特異度均超過90%，敏感度分別為91.7%和83.3%。說明利用該技術在福州地區快速檢測耐多藥結核分枝桿菌有較好的適用性。

本次研究還發現，福州地區耐RIF結核分枝桿菌中，rpoB基因S531L位點突變最頻繁(58.3%)，該突變特征與福建省MDR菌株rpoB基因的突變特征報道相符[11]。而Paolo Mitto的研究表明rpoB基因突變最頻繁的是D516L(43.8%), S531L的突變率則為9.4%[12]。這種差異可能與不同地區流行菌株差異有關。本研究中，6例耐多藥MTB中，50%也存在rpoB基因S531L突變。因此在實驗結果分析時要特別注意S531L位點突變。

本研究顯示katG基因突變以315位點突變為主，inhA基因突變以C15T位點突變為主。在所有INH突變株中，315位點突變率(57.7%)低于福建省MDR菌株katG基因的突變特征(73.42%)報道[11]。而inhA基因C15T位點突變率(42.3%)比福建省(11.39%)和北京地區(21.6%)均高出許多[11,13]。這些存在C15T位點突變菌株僅一株為INH耐藥菌株，與傳統藥敏試驗相比，檢測inhA耐藥基因的Kappa值僅為0.079，建議謹慎判斷inhA基因C15T位點突變引起的INH耐藥。

本試驗結果說明福州地區INH耐藥結核菌株多與katG耐藥基因突變有關。本研究中我們發現，在246株結核分枝桿菌中有3株INH耐藥株用MTBDRplus技術未檢出katG和inhA耐藥突變。說明除了katG和inhA耐藥基因外可能還有其它基因突變引起INH耐藥突變，如kasA、ahpC及oxyR基因[14]。MTBDRplus技術敏感性高，特異性強，但也存在一定的局限性[1]。如對檢測INH是否耐藥僅對最常見的katG和inhA2個基因進行檢測，而未對耐藥基因突變有關的其它基因進行檢測，故其敏感度和特異度相較于RIF耐藥檢測偏低。另外，除突變引起耐藥外，分枝桿菌存在藥物主動外排泵的表達，也可能與INH耐藥相關[15-16]。

福州屬于南方沿海城市，NTM引起的肺病相對內陸地區更為嚴重，福建省NTM臨床分離率占分枝桿菌培養陽性株的10.2%[17]。本研究利用MTBDRplus技術區分結核分枝桿菌與NTM的敏感度和特異度均為100%。因此，利用MTBDRplus技術對NTM肺病與結核病進行篩查，對NTM肺病與結核病的鑒別診斷和治療有重要意義。

總之， MTBDRplus技術快速、靈敏度高，特異性好，能早期發現耐藥，尤其是耐多藥病人。對于耐藥病人而言，盡早實施個體化治療方案對于病人的規范治療和早期治愈提供保障，從公共衛生角度而言，早期發現耐藥病人可有效發現并控制傳染源，阻斷耐藥結核病的傳播。