鮑曼不動桿菌誘導Raw 264.7細胞自噬研究

DinshKumarK,吳亮姜旭淦陰晴陳盛霞許化溪

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)是一種臨床常見的革蘭陰性桿菌，是引起醫院內感染的主要病原菌，常引起ICU、腦外科和呼吸內科等病區暴發感染[1]。近年來，鮑曼不動桿菌耐藥性升高迅速，多重耐藥菌和泛耐藥菌分離率逐年上升[2]。目前我國臨床多重耐藥鮑曼不動桿菌檢出率已經超過銅綠假單胞菌，居革蘭陰性菌中首位，有“革蘭陰性MRSA”之稱[3-4]。

自噬是廣泛存在于真核細胞中的一種特殊的死亡現象，其本質是細胞吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并將其包被進入囊泡中，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，以降解其所包裹的內容物。因此自噬不僅可以清除細胞內受損、老化細胞器以及錯誤折疊蛋白質，還可以在早期清除侵入細胞的病原微生物[5]。而近年來，自噬在哺乳動物抵抗病原體感染中所發揮的作用越來越引起人們的研究興趣，現已發現多種病毒、細菌、真菌和寄生蟲可以誘導哺乳動物細胞發生自噬現象[6-7]。

在人體細胞中巨噬細胞是抵御病原體入侵的“第一道屏障”，可以在病原體侵入早期發揮吞噬清除作用。在各種病原體感染過程中，如果僅誘發人體巨噬細胞發生有限自噬可以幫助機體清除侵入的病原體并防止感染擴散，但當巨噬細胞發生無限制自噬時，則會導致患者抵抗力下降無法有效清除侵入的病原體，進而造成感染范圍擴大并導致嚴重后果[8-9]。鮑曼不動桿菌是一種常見臨床致病菌，目前尚無該菌誘導巨噬細胞自噬的研究報道。本研究探討了鮑曼不動桿菌誘導鼠巨噬細胞自噬能力及機制，現將結果匯報如下。

1 材料與方法

1.1菌株和細胞 鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC17978由本課題組保存。鼠巨噬細胞Raw 264.7購自中國科學院上海生科院細胞資源中心，由本課題組擴增培養后于液氮中大量凍存，取復蘇后3～7代細胞用于后續實驗。

1.2實驗試劑 RPIM 1640細胞培養液購于南京培源生物科技有限公司，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自美國GBICO公司，細胞培養級胰蛋白酶購自美國HyClone公司，血瓊脂平板購于鄭州安圖生物有限公司，酵母提取物和胰蛋白酶均購于OXOID公司，LC3抗體和Beclin-1抗體購自美國Cell Signaling Technology(CST)公司，羊抗兔IgG抗體購自美國ABclone公司，RIPA裂解液購自南通碧云天公司，細胞總RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，反轉錄試劑盒和qPCR試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，PVDF膜(0.45 μm)和ECL曝光液購自美國Millipero公司，細胞培養耗材購自廣州潔特公司，其他試劑均為國產分析純，PCR引物參考相關文獻由蘇州泓訊生物科技有限公司合成(見表1)[10-12]。

表1 目的基因引物序列及長度
Tab.1 PCR primers and the length of PCR products

基因引物序列(5′-3′)長度/bpatg5F:CTTGCATCAAGTTCAGCTCTTCC R:AAGTGAGCCTCAACCGCATCCT107atg7F:CCTGTGAGCTTGGATCAAAGGCR:GAGCAAGGAGACCAGAACAGTG147atg12F:GAAGGCTGTAGGAGACACTCCTR:GGAAGGGGCAAAGGACTGATTC157ULK1F:CAGTCACCCACCCAGTTCCAAR:CCTCCACCCAGAGCATCTTCC152GABARAPL1F:TATCGGAAAAAGGAAGGAGAAAR:CAACAGTAAGGTCAGAGGGCAC136atg3F:GTCCCTTATTAGAGAAACTGTATR:AGAATATGACTACACAAGACACT147atg4BF:AGGTGCTAACACGGGGCTR:CGGGAGGCCTTACTGCTT134atg16L1F:GTCAGGCCTTATCACACTCTCCR:CAGAACCTCTCTCCCTGTCC146β-actinF:CATTGCTGACAGGATGCAGAAGGR:TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG138

1.2細胞和細菌傳代培養 Raw 264.7細胞培養于含15% FBS的RPMI 1640培養液，當細胞生長融合至70%時，以0.25%濃度胰蛋白酶消化收集細胞，6孔細胞板中每孔接種1×106個細胞并繼續置于37 ℃ 5% CO2條件下培養24 h用于后續研究。保存于15%脫脂牛奶中鮑曼不動桿菌于血瓊脂平板上四區劃線生長，經37 ℃培養12 h后挑取單個菌落接種于3 mL LB液體培養基中，以200 r/min振蕩培養10 h后離心收集細菌。細菌以pH 7.2無菌磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline, PBS)洗滌3次，再以PBS緩沖液重懸至OD600=1備用。

1.3細菌-細胞共培養 按細菌數量:細胞數量(multiplicity of infection, MOI)=10∶1比例將鮑曼不動桿菌和Raw264.7細胞共培養，同時設未感染細菌對照組。于感染30 min時加入終濃度100 μg/mL慶大霉素殺死未進入細胞內細菌，以無菌PBS緩沖液洗滌2次徹底除去游離細菌，繼續培養至180 min時中止實驗，收集培養物用于后續研究。整個實驗重復3次。

1.4Western blotting法檢測 RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白用于Western blotting法檢測。總蛋白樣本通過SDS-PAGE電泳分離，經350 mA恒流轉印至PVDF膜。LC3抗體和Beclin-1抗體均以1∶1 000倍稀釋后4 ℃孵育過夜。次日以TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。羊抗兔IgG經1∶2 000倍稀釋后室溫孵育1 h。在PVDF膜上滴加適量ECL曝光液，顯影并記錄。

1.5qPCR法檢測 嚴格按照百泰克公司細胞總RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，并反轉錄為cDNA用于qPCR檢測。qPCR反應條件是95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，共40個循環。記錄目的基因與內參的CT值，將目的基因與內參基因比較后再與對照組比較，計算atg mRNA相對表達量。

1.6統計學分析 使用SPSS16.0統計學軟件，采用Students’ t法分析感染組和正常組細胞基因和蛋白表達差異，P<0.05時差異有統計學意義。

2 結 果

2.1Raw264.7細胞自噬相關基因表達 感染鮑曼不動桿菌180 min時，感染組細胞atg5、atg7、atg12、ULK1、GABARAPL1、atg3、atg4B和atg16L1基因表達量與對照組無統計學差異(F(atg5)=0.9918；F(atg7)= 0.9697；F(ULK1)= 0.9871；F(GABARAPL1)=0.8585；F(atg3)=0.9662；F(atg4B)=0.7181；F(atg16L1)=0.7794，P>0.05)，僅atg12基因表達量高于對照組(F=208.6，P<0.01)(見圖1)。

**：P<0.01圖1 Raw264.7細胞自噬相關基因表達Fig.1 Autophagy related genes expression in Raw 264.7 cells

2.2Raw264.7細胞LC3和Beclin-1蛋白表達 感染鮑曼不動桿菌180 min時，感染組細胞LC3和Beclin1蛋白表達量均高于對照組(F(LC3)=457.2；F(Beclin-1)=43.27，P<0.01)(見圖2)。

**：P<0.01圖2 Raw264.7細胞自噬相關蛋白LC3和Beclin-1表達Fig.2 Autophagy related proteins LC3 and Beclin-1 expression in Raw 264.7 cells

3 討 論

鮑曼不動桿菌是引起院內感染暴發的重要病原菌，常引起肺部感染，而肺部巨噬細胞在抵御和清除鮑曼不動桿菌感染中發揮重要作用。巨噬細胞吞噬鮑曼不動桿菌后，可形成吞噬囊泡結構，并與溶酶體融合形成自噬相關溶酶體，啟動細胞自噬進而殺滅侵入的鮑曼不動桿菌[13]。通過啟動被感染細胞自噬可以殺滅侵入細胞的各種病原微生物，防止感染的進一步擴散。多種病原體已被證實可以誘發宿主巨噬細胞自噬，目前尚未見鮑曼不動桿菌誘導巨噬細胞自噬的研究報道[14-18]。

近些年的研究成果表明患者自噬發生程度與病原體致病力關系密切[6, 19]。鮑曼不動桿菌所引起患者呼吸道嚴重感染可誘發膿毒血癥，其臨床病死率極高[20]。在膿毒血癥中，細菌感染誘發巨噬細胞發生不可控自噬或，大量巨噬細胞的自噬可以釋放過量活性氧(reactive oxygen species, ROS)，在殺滅侵入病原體的同時，也會造成患者肺正常組織損傷，并進一步導致肺功能的衰竭，這是造成患者死亡重要原因之一[21]。我們的研究結果表明，鮑曼不動桿菌的感染可誘導Raw 264.7細胞自噬相關蛋白LC3和Beclin-1表達量增高，提示鮑曼不動桿菌能夠誘導Raw 264.7細胞發生自噬。通過qPCR法進一步研究發現，鮑曼不動桿菌感染可上調Raw 264.7細胞atg12基因表達量。ATG7-ATG4-ATG 8和ATG12- ATG7- ATG5是2條經典的自噬信號傳導通路，2條自噬途徑均依賴于Beclin-1蛋白的表達(ATG6)。綜合我們的研究結果，我們推測鮑曼不動桿菌可以通過ATG12- ATG7- ATG5途徑誘導Raw 264.7細胞自噬，但其具體機制仍有待于進一步研究。