多重耐藥肺炎克雷伯菌62種耐藥基因元件的檢測與gyrA基因突變的發現

據國家衛生健康委員會合理用藥專家委員會2016年全國細菌耐藥監測網報告，肺炎克雷伯菌僅次于大腸埃希菌占革蘭陰性桿菌臨床分離率第2位(達19.7%)。肺炎克雷伯菌對第3代頭孢菌素的耐藥率全國平均為 34.5%，對第3代頭孢菌素耐藥率最高的省份達為 58.1%。肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率全國平均為8.7%(較2015年上升了1.1%),肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥率最高的地區達23.6%[1]。可見肺炎克雷伯菌臨床分離率居高位,況且耐藥性突出。我們收集25株耐藥肺炎克雷伯菌進行了62種耐藥元件基因檢測,結果發現了2株不僅存在gyrA基因突變、同時又攜帶了blaKPC、rmtB基因的對喹諾酮類藥物、碳青霉烯類藥物、第3代頭孢菌素、氨基糖苷類藥物均為耐藥肺炎克雷伯菌,現報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源及菌種鑒定 25株耐藥肺炎克雷伯菌均分離自2016-2017年江漢油田總醫院住院病人標本。菌種鑒定為gyrA基因測序上網BLASTn比對法(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn),實驗中非肺炎克雷伯菌已剔除。

1.2藥敏試驗 10種抗菌藥物藥敏試驗為K-B紙片擴散法。10種抗菌藥物依次為：頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、美洛培南、慶大霉素、阿米卡星、環丙沙星、左氧氟沙星。藥敏紙片為英國Oxoid公司產品。藥敏試驗判斷依據為2016年發布的CLSI M100-S26文件。

1.3細菌DNA制備 為非離子去污劑裂解和蛋白酶K溶液法，試劑盒為無錫市克隆遺傳技術研究所產品。

1.4獲得性耐藥元件基因檢測 25株耐藥肺炎克雷伯菌62種耐藥元件基因檢測均為PCR法。檢測項目見表1，引物序列由無錫新吳區新克隆數據分析工作室提供。試劑盒為無錫市克隆遺傳技術研究所產品。各種耐藥元件基因檢測體系為: 正向P1引物P1 1 μL(1.0 μmol/L)、反向P2引物P2 1 μL(1.0 μmol/L),預混的dNTPs 2 μL (dATP、dTTP、dCTP、dGTP均為2 mmol/L),緩沖液2 μL [MgCl22mmol/L，Tris-HCl(pH9.0)10 mmol/L]，重組的rTaq DNA聚合酶1單位,純水9 μL, DNA制備液5 μL,反應容量20 μL。PCR擴增參數為： 93 ℃預變性2 min下同，然后93 ℃ 1 min→55 ℃ 1 min→72 ℃ 1 min，循環30次，最后一個72 ℃延長至5 min，產物作2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線儀下觀察結果。

1.5基因測序與分析 DNA測序委托上海鉑尚生物技術公司完成。測得序列比對與分析在無錫新吳區新克隆數據分析工作室協助下完成。

1.6菌株親緣關系分析 對62種耐藥元件基因檢測結果作UPGMA法樣本聚類分析,由無錫新吳區新克隆數據分析工作室完成。

2 結 果

2.1藥敏檢測結果 25株耐藥肺炎克雷伯菌10種抗菌藥物藥敏試驗檢測結果見表2。

2.2耐藥元件基因檢測結果 25株耐藥肺炎克雷伯菌每株均檢出β-內酰胺類藥物耐藥相關基因(即β-內酰胺類藥物耐藥相關基因總陽性率達100.00%)；有24株菌檢出氨基糖苷類藥物耐藥相關基因(即氨基糖苷類藥物耐藥相關基因總陽性率達96.00%)；有20株菌檢出喹諾酮類藥物耐藥相關基因gyrA突變(即突變率為80.00%)；每株均檢出可移動遺傳元件遺傳標記基因(即可移動遺傳元件遺傳標記基因總陽性率達100.00%),各類耐藥元件基因陽性率見表3。本研究25株耐藥肺炎克雷伯菌中20株存在喹諾酮類藥物耐藥相關基因gyrA第83位密碼子發生了同樣的突變,且均無第87位密碼子的突變(見圖1),blaKPC、rmtB基因DNA測序見圖2、3。

表1 25株耐藥肺炎克雷伯菌耐藥元件基因檢測項目
Tab.1 Resistant determinants in 25 strains of drug-resistantKlebsiellapneumoniae

基因分類基因名稱β-內酰胺類藥物耐藥相關基因(β-內酰胺酶基因,35種)1.A類β-內酰胺酶基因:blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1群、blaCTX-M-2群、blaCTX-M-8群、blaCTX-M-9群、blaCTX-M-25群、blaPER、blaVEB、blaGES、blaCARB、blaRTG、blaLAP、blaKPC;2.B類β-內酰胺酶基因:blaIMP、blaVIM、blaDIM、blaSIM、blaSPM、blaGIM、blaAIM、blaNDM、blaKHM、blaTMB ;3.C類β-內酰胺酶基因:blaLEN、blaOKP、blaDHA群、blaACT/MIR群、blaLAT/CMY群、blaMOX/CMY群、blaFOX群、blaACC群;4.D類β-內酰胺酶基因:blaOXA-1群、blaOXA-2群、blaOXA-10群氨基糖苷類藥物耐藥相關基因(15種)1.氨基糖苷類修飾酶基因:aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6’)-Ⅰb、aac(6’)-Ⅱ、ant(2”)-Ⅰ、ant(3”)-Ⅰ、ant(4’)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ、aadA5;2.靶位16S rRNA甲基化酶基因:armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA喹諾酮類藥物耐藥相關基因(1種)gyrA基因突變可移動遺傳元件遺傳標記基因(11種)1.整合子遺傳標記基因:intⅠ1、intⅠ2、intⅠ3;2.轉座子遺傳標記基因:tnpU、tnp513;3.插入序列遺傳標記基因:ISEcp1、IS26、IS903、ISKpn6、ISKpn7;質粒遺傳標記基因:trbC

表2 25株耐藥肺炎克雷伯菌10種抗菌藥物藥敏試驗檢測結果
Tab.2 Result of drug sensitivity test of 25 drug-resistantKlebsiellapneumoniato 10 antimicrobial agents

藥物名稱敏感中介耐藥株數敏感率/%株數中介率/%株數耐藥率/%頭孢呋辛00.00520.002080.00頭孢噻肟00.00520.002080.00頭孢他啶00.00520.002080.00哌拉西林/他唑巴坦1560.0000.001040.00亞胺培南2392.0000.0028.00美洛培南2392.0000.0028.00慶大霉素14.0000.002496.00阿米卡星14.0000.002496.00環丙沙星520.0000.002080.00左氧氟沙星520.0000.002080.00

2.3菌株親緣關系分析 25株耐藥肺炎克雷伯菌62種耐藥元件基因的檢測結果作樣本聚類分析顯示,可分A與B 2個簇群，2個簇群中均有克隆傳播(見圖4)。

3 討 論

肺炎克雷伯菌不僅在臨床標本中分離率高,近幾年對抗菌藥物耐藥率不斷上升，甚至出現了耐多粘菌素的菌株[1-6]。因此耐藥肺炎克雷伯菌是國內感染學領域研究與追蹤熱點[7-14]。

本文25株耐藥肺炎克雷伯菌對第3代頭孢菌素(頭孢噻肟、頭孢他啶)、氨基糖苷類藥物(慶大霉素、阿米卡星)、喹諾酮類藥物(環丙沙星、左氧氟沙星)的敏感性均較低(敏感性均不足20.0%,見表2)，

表3 25株耐藥肺炎克雷伯菌耐藥元件基因檢測陽性率
Tab.3 Positive rates of resistance determinants in 25 drug-resistantKlebsiellapneumonia

分類基因名稱陽性株數%β-內酰胺類藥物耐藥相關基因blaTEM25100.00blaLAP1 4.00blaKPC2 8.00blaDHA群936.00blaOXA-1群312.00氨基糖苷類藥物耐藥相關基因aac(3)-Ⅱ1872.00aac(6’)-Ⅰb624.00ant(3”)-Ⅰ1560.00aph(3’)-Ⅰ936.00aadA52 8.00rmtB832.00喹諾酮類藥物耐藥相關基因gyrA突變2080.00可移動遺傳元件遺傳標記基因intⅠ125100.00tnpU1144.00tnp5131664.00ISEcp11872.00IS262288.00IS9032288.00ISKpn62 8.00trbC1768.00

注： 未列出檢測結果者均為檢測呈陰性。

對復合制劑氨(哌拉西林/他唑巴坦)敏感率為60%尚可。對碳青霉烯類藥物(亞胺培南、美洛培南)均為敏感,敏感率均達92.00%。

注：gyrA基因喹諾酮類藥物耐藥決定區常見為密碼子第83,87位2個位點發生突變,本文20株gyrA突變菌株均為第83位發生突變,第87位無突變發生。圖1 喹諾酮類藥物耐藥相關基因gyrA突變分析Fig.1 gyrA mutation analysis of resistant genes to quinolones

本文菌株作了β-內酰胺類藥物耐藥相關基因共35種β-內酰胺酶基因檢測,結果A類β-內酰胺酶基因檢出blaTEM、blaLAP、blaKPC；B類β-內酰胺酶基因沒有檢出；C類β-內酰胺酶基因檢出blaDHA群；D類β-內酰胺酶基因檢出blaOXA-1群(各項檢出率詳見表2)。25株均檢出β-內酰胺酶基因。A類β-內酰胺酶基因中blaKPC表達具碳青霉烯類藥物水解活性的β-內酰胺酶,因此產KPC酶的菌對碳青霉烯類藥物耐藥。本研究菌株有2株呈陽性(8.00%),與碳青霉烯類藥物耐藥率相符(8.00%)。C類β-內酰胺酶基因表達AmpC型β-內酰胺酶，β-內酰胺酶抑制劑對該類酶無抑制作用。

圖2 blaKPC測序(部分) Fig.2 Part sequence of bla KPC

圖3 rmtB測序(部分) Fig.3 Part sequence of rmtB

圖4 25株耐藥肺炎克雷伯菌62種耐藥元件基因檢測結果的樣本聚類分析(圖中數字為菌株號) Fig.4 Sample cluster analysis of 62 resistance determinants in 25 drug-resistant Klebsiella pneumonia

本組菌株9株檢出C類β-內酰胺酶基因blaDHA群(36.00%),與哌拉西林/他唑巴坦復合制劑耐藥率40.00%大體一致。

本研究25菌株中有24株菌檢出氨基糖苷類藥物耐藥相關基因(即氨基糖苷類藥物耐藥相關基因總陽性率達96.00%),與氨基糖苷類藥物耐藥率一致。氨基糖苷類藥物耐藥相關基因有氨基糖苷類修飾酶和靶位16S rRNA甲基化酶基因二類。氨基糖苷類修飾酶的耐藥機制為, 修飾酶對氨基糖苷類藥物的化學基團進行修飾,導致氨基糖苷類藥物完全失效或部分失效。氨基糖苷類藥物新藥研發思路即為改變已知氨基糖苷類修飾酶修飾部位的化學基團,使得原先氨基糖苷類修飾酶無法修飾新的氨基糖苷類藥物。16S rRNA甲基化酶的耐藥機制為, 甲基化酶對氨基糖苷類藥物作用的靶位甲基化,導致氨基糖苷類藥物無法作用而失效。亦即16S rRNA甲基化酶引起的耐藥較氨基糖苷類修飾酶引起的耐藥更為嚴重。16S rRNA甲基化酶的出現直接導致原先的氨基糖苷類藥物新藥研發思路無用了。本研究25菌株中有8株菌(32.00%)檢出16S rRNA甲基化酶基因rmtB,即該8株對未來的氨基糖苷類藥物新藥亦將耐藥。

喹諾酮類藥物耐藥主要原因為細菌的藥物作用靶位DNA回旋酶編碼基因gyrA突變,變異后的DNA回旋酶不與喹諾酮類藥物結合,藥物無效。gyrA基因突變常見發生于密碼子第83、87位2個位點。本文25菌株中有20株gyrA發生突變(均為第83位發生突變,第87位無突變)。

近年國內有較多耐藥肺炎克雷伯菌耐藥基因研究報道,但主要涉及β-內酰胺類藥物耐藥相關基因和氨基糖苷類藥物耐藥相關基因的報道較多[7-14]。涉及喹諾酮類藥物耐藥相關基因的報道較少[13-14]。

本文菌株可移動遺傳元件遺傳標記基因檢出率較高, 整合子遺傳標記基因、轉座子遺傳標記基因、插入序列遺傳標記基因、質粒遺傳標記基因均有檢出,檢出率詳見表3。可移動遺傳元件是β-內酰胺類藥物耐藥相關基因和氨基糖苷類藥物耐藥相關基因的載體,本文菌株該三者檢出率高能互為佐證。

本文對25株耐藥肺炎克雷伯菌62種耐藥元件基因檢測結果作了樣本聚類分析,從圖4可見菌株分A與B二簇群, 2個簇群中均有克隆傳播。A簇群中有2個克隆,分別為2號株-3號株-5號株-16號株等4株、13號株-14號株等2株；B簇群中有1個克隆,為19號株-20號株等2株。其中A簇群中13號株和14號株均存在gyrA突變,同時攜帶了blaKPC、rmtB、ant(3”)-Ⅰ、intⅠ1、tnp513、ISEcp1、IS26、IS903、ISKpn6基因。13號株和14號株的gyrA突變決定它們對喹諾酮類藥物耐藥,攜帶blaKPC導致對碳青霉烯類藥物、第3代頭孢菌素耐藥,攜帶rmtB導致對氨基糖苷類藥物耐藥。這3個基因導致菌株對一線抗菌藥物均為耐藥。