北京和非北京基因型結核分枝桿菌生長曲線及mazEF系統的研究

據世界衛生組織全球結核病報告顯示2017年全球有1 040萬人患結核病，中國肺結核發病數為835 198例，死亡人數為2 823人[1]。伴隨著HIV感染的流行、耐藥菌株的出現及流動人口的增加，全球結核病形勢急劇惡化。全球約20億人曾受到結核分枝桿菌的感染[2]。結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)的流行存在地區差異，據WHO調查報告，印度、中國、印度尼西亞、菲律賓和巴基斯坦等5個國家的結核病新發病例占56%[3]，在中國，北方北京基因型菌株所占的比例高于南方，新疆是中國結核病發病較高的地區之一，新疆的主要流行MTB是北京基因型菌株[4-5]。MTB引起的結核病(Tuberculosis, TB)是全球最常見的慢性傳染性疾病之一，MTB在傳播和進化過程中形成了7個感染人類的譜系，其中北京基因型菌株是全球廣泛傳播的譜系之一[6]。北京基因型菌株比其他MTB基因型菌株毒性強、突變率高，有耐藥傾向，易傳播，易復發[7]，在動物中表現出高致病性和高死亡率[8]。TAS廣泛存在于非嚴格胞內寄生的細菌中[9]。MTB染色體上存在大量的毒素-抗毒素分子，研究顯示毒素抗毒素分子與大腸桿菌潛伏感染、持續感染、休眠耐藥、生物膜的形成和對抗環境壓力密切相關[10]。mazEF系統是分布最廣泛的II型TAS，mazF是毒素，化學性質是核糖核酸內切酶，切割mRNA具有序列特異性，推測MTB的mazF像大腸桿菌的一樣，參與細菌的持留、程序性死亡以及對抗生素藥物的耐受[11]。mazE是抗毒素，化學性質不穩定，mazE通過與mazF形成復合物抑制mazF的核糖核酸內切酶活性，從而保護胞內mRNA，使蛋白得以正常合成，使mazF失去對細胞生長的抑制和程序性死亡的作用[12]。

本文旨在研究新疆北京及非北京基因型菌株的生長曲線、mazEF3,6,9系統表達的差異性，探索mazEF系統是否與北京基因型菌株流行相關，為進一步研究結核病的傳播、致病機制及其防治措施提供參考依據。

1 材料與方法

1.1菌株及鑒定 MTB臨床分離株為本課題組成員前期從新疆開放性肺結核患者的痰液中分離培養所得，已完成菌株鑒定及北京基因型和非北京基因型鑒定，采集地點、菌株數、培養、鑒定的方法詳見參考文獻[13]，菌株保存在石河子大學教育部重點實驗室細菌室。北京、非北京基因型MTB的mazEF3、mazEF6、mazEF9基因的缺失和過表達菌株前期已完成構建及鑒定[14]，由本實驗室保存。所有菌株的培養和鑒定均遵循中國防癆協會結核病診斷細菌學檢驗規程[15]。

1.2不同培養條件下北京、非北京基因型菌株的生長曲線測繪 將菌株接種在含有甘油和吐溫80的7H9肉湯(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)中，對置于37 ℃恒溫搖床培養箱中的北京、非北京基因型菌株以及二者的mazEF3、mazEF6、mazEF9基因的缺失突變和過表達菌株在無菌培養的第2、4、6、8、10 d，用細菌濁度儀檢測細菌的光密度(OD600)值，并以細菌的OD值為縱坐標，以培養時間為橫坐標，繪制各實驗菌株在標準、低氧、營養饑餓培養條件下的生長曲線。細菌的OD值即細菌的光密度值，主要由細菌的菌數多少決定其OD值的高低，OD值越高，表明菌數越多，菌數多表明其生長繁殖快。在上述3種條件下培養，北京、非北京基因型菌株，起始的OD值(菌數)是一致的。標準條件的培養液為配制的7H9液體，試管用通氣的塞子硅膠塞塞住；低氧條件的培養液也為配制好的7H9液體，但是用不通氣的橡膠塞；營養饑餓條件用PBS代替7H9培養液，先把菌液用PBS洗3遍，每次洗完離心，離心后重懸。

1.3北京和非北京基因型MTBmazEF系統mRNA水平的檢測 取對數生長期的MTB菌落，使用RNeasy Plus Universal mini kit RNA(德國QIAGEN公司)提取試劑盒提取總RNA。紫外分光光度法用于測定RNA濃度和純度，使用TianScript cDNA(Tiangen)合成試劑盒進行第一鏈cDNA合成。將得到的cDNA用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度后，置cDNA溶液于-80 ℃冰箱貯存。通過GeneBank查找mazE3 6 9、mazF3 6 9及mazEF3 6 9的基因序列，qRT-PCR特異性引物通過Primer 5.0軟件設計，結果見表1。引物合成由上海生物工程有限公司完成。

qRT-PCR反應條件：50 ℃ 2 min激活SYBR酶活性，95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環。溶解曲線參數：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。

對所有樣本的每個基因均做3個復孔，取其平均值，獲得各樣本的Ct值。以sigA的拷貝數作為校正基數，△Ct=[Ct(sample)]-[Ct(sigA)]，2-△ct即為該樣本目的基因相對于內參的表達量。△△Ct=[△Ct(test)]-[△Ct(control)]，2-△△ct為實驗組相對于對照組目的基因的相對表達量。

表1mazEF基因的qRT-PCR引物序列
Tab.1 Sequences ofmazEFgene primers for qRT-PCR

GeneSequence(5′→3′)GeneSequence(5′→3′)mazE3F: CCAGCGTATCCAGATCACCmazF3F: TATGACACCACCCAATCGR:GCGGGTGCATACCAAACTR:ACCTATCCACTACGCACAGCmazE6F: TCACCACTCATCGTCCTGmazF6F: GGTCGGTGAGGTCAGTCTTGR:ATGAAGACAGCTATTTCTCTGCCR:GGTGATTAGTCGTGCCGAGATmazE9F: CATGCGTTGGCATAGTCATCmazF9F: TCAAAGCCTCATCGAGCTGR:TATGTGAAACGAGCGGGATTR:GAGGTAGCGAAGCGAACAACsigAF: TCGAGGTGATCAACAAGCTGMazEF3F:AGGATCAGGACGGGTCTAGCR:CTGCAGCAAAGTGAAGGACAR: CACGGGTGATCTGGATACGMazEF6F: ATCTGACTGGATTACGAGCACMazEF9F: CGACAACAACACCTGAAACGR: TGGACGATGAGTGGTGAGTR: GTAGCGAAGCGAACAACCAG

1.4北京和非北京基因型菌株mazEF系統蛋白表達水平的檢測 將保存在-80 ℃冰箱中的處于對數生長期的菌懸液，置于冰上融解15 min。向EP管中加入Native Lysis Buffer(已加入溶菌酶和核酸酶)2 mL，待菌懸液完全融解后，離心去除培養液，將MTB重懸浮于Native Lysis Buffer中。將EP管置于冰上孵育30 min，輕輕渦旋混勻細菌懸浮物2～3次。將溶菌產物置于4 ℃離心機中離心，取上清。用紫外分光光度計檢測蛋白的純度及含量。加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，將蛋白樣本置于100 ℃加熱器上進行變性處理、分裝，置于-80 ℃儲存。使用Western blot技術檢測其蛋白表達水平。MazF蛋白單克隆抗體的合成由北京博爾邁公司完成，其中MazF3和MazF6單抗不能合成，因其制備過程中過表達質粒導入工程菌時，導致工程菌大量死亡，不能獲得足量蛋白(抗原)用于制備單抗，推測MazF3和MazF6蛋白的毒性遠遠高于MazF9蛋白。因此本實驗只檢測各實驗菌株MazF9的表達水平。查閱文獻抗毒素MazE蛋白不穩定、易降解，只有與毒素MazF結合后才穩定，又咨詢了博爾邁公司技術部門的相關人員，認為制備MazE單克隆抗體的風險太大，所以最終放棄制備MazE單克隆抗體。運用Image Lab和Photoshop軟件對所檢測的目標圖像進行分析，計算目的蛋白灰度值與其面積的乘積，以及內參蛋白灰度值與其面積的乘積，兩者之比即為目的基因相對內參基因的蛋白表達量。

1.5統計分析 實驗結果采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，采用t檢驗進行統計學差異分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同培養條件下北京、非北京基因型菌株的培養結果 通過檢測不同培養條件下北京和非北京基因型MTB在第2、4、6、8、10 d的細菌光密度OD值，繪制各菌株在不同培養環境中的生長曲線。結果顯示，與非北京基因型菌株相比，北京基因型菌株在標準和低氧條件下培養的第4、6、8、10 d，營養饑餓條件下培養的第2、4、6、8 d，細菌的OD值均較高，且差異有統計學意義(P<0.05)(圖1)。說明北京基因型菌株菌數均高于非北京基因型菌株的。觀察北京基因型菌株和非北京基因型菌株的mazEF3、mazEF6、mazEF9基因的缺失和過表達菌株在標準、低氧和營養饑餓條件下培養繪制的生長曲線，總體趨勢北京和非北京基因型MTB缺失突變株和過表達菌株的OD600小于其對應的親本株，說明親本株菌株菌數多、繁殖力強，見圖2。

2.2北京和非北京基因型MTBmazEF系統mRNA水平的檢測結果mazEF基因mRNA相對表達量：以細菌的cDNA為模板，用表1中mazEF3 6 9的引物，進行實時熒光定量PCR檢測其mRNA表達水平。北京基因型菌株與非北京基因型菌株mRNA表達水平相比較，mazEF3 mRNA高表達9.55倍(t=1.780，P<0.05)，雖然mazEF6 9高表達，但無統計學意義(tmazEF6=0.798，P>0.05)(圖3a)；mazE9低表達5.16倍(t=1.937，P<0.05)，mazE3低表達和mazE6高表達，但無統計學意義(tmazE3=1.012,tmazE6=1.534,tmazEF9=0.762，P>0.05)(圖3b)；mazF3高表達4.86倍，mazF6高表達2.64倍，mazF9高表達5.37倍(tmazF3=2.815,tmazF6=3.000,tmazF9=3.633，均P<0.01)(圖3c)。

注：北京和非北京基因型菌株在標準條件(a)低氧條件(b)和營養饑餓條件(c)標準條件下：4 d的t=1.680；6 d的t=1.880；8 d的t=2.224；10 d的t=1.754；氧氣缺乏條件下：4 d的t=0.383；6 d的t=1.741；8 d的t=1.779；10 d的t=1.224；營養饑餓條件下：2 d的t=2.116；4 d的t=2.537；6 d的t=1.102；8 d的t=0.667下的培養結果；*P<0.05圖1 不同培養條件下北京和非北京基因型菌株的生長曲線Fig.1 Growth curves of Beijing and non-Beijing genotype strains under different culture conditions

注：a. 北京基因型菌株及其缺失和過表達菌株在不同培養條件下的生長曲線；b. 非北京基因型菌株及其缺失和過表達菌株在不同培養條件下的生長曲線。圖2 結核分枝桿菌及其mazEF3,6,9基因缺失和過表達菌株的生長曲線Fig.2 Growth curves of MTB strains as well as their mazEF 3,6,9 genes deletion and overexpression strains

注： * P<0.05;** P<0.01; a. 北京和非北京基因型菌株mazEF系統基因mRNA的表達水平；b. 北京和非北京基因型菌株mazE基因mRNA的表達水平；c. 北京和非北京基因型菌株mazF基因mRNA的表達水平。圖3 結核分枝桿菌mazEF系統在mRNA水平上的表達結果Fig.3 Expression results of mazEF systems in MTB strains at mRNA levels

2.3北京和非北京基因型MazF9蛋白水平的檢測結果 提取MTB的蛋白，以GAPDH作為內參蛋白，使用Western Blot技術檢測其蛋白表達水平。北京基因型與非北京基因型菌株相比，其MazF9蛋白高表達1.62倍，差異有統計學意義(t=9.009，P<0.01)(圖4)。

注：1是北京基因型菌株；2是非北京基因型菌株；** P<0.01。圖4 mazF9蛋白在北京和非北京基因型菌株中的表達Fig.4 Expression levels of MazF9 protein in Beijing and non-Beijing genotype strains

3 討 論

1995年，Van Soolingen[16]等人在中國北京及周邊地區首次發現并報道MTB北京基因型菌株，將其命名北京型菌株。全球MTB臨床分離株的13%是北京基因型菌株，并導致了全世界1/3的TB[17]。與非北京基因型菌株相比，北京基因型菌株具有一定的選擇優勢，傳播速度更快，毒力更強，往往更加致命[18]。究竟什么原因賦予北京基因型菌株的這些特點還不完全清楚，被認為是相關特定分子的內在表達變化所決定。研究結果顯示，北京和非北京基因型菌株其生長曲線總體趨勢都是標準條件下的OD值高于低氧及營養饑餓條件，正常標準培養條件下，由于氧氣、營養充足、充分，適合MTB生長繁殖，OD值高；低氧條件下OD值低，MTB生長輕度受限，這種不利條件也是促進MTB持留生存的因素之一；營養饑餓條件下OD值最低，說明MTB生長速度最慢，繁殖速度降低以利于存活，也許這與MTB入侵人體被巨噬細胞吞噬后不被清除變為休眠菌機制相一致。與非北京基因型菌株相比，北京基因型菌株在低氧、營養饑餓的條件下OD值均高，即在不利條件下，北京基因型菌株生長繁殖速度快于非北京基因型菌株，說明其對低氧、營養饑餓不利條件耐受性較好，在壓力條件下生存能力強，這也許是北京基因型菌株易流行的原因之一。是MTB什么內在的因素造成了這種不同，作者初步探索了MTB菌株的毒素-抗毒素mazEF系統與其生長繁殖的相關性。

毒素-抗毒素(TAS)由毒素蛋白和同源的抗毒素組成，mazEFTAS能夠促進程序性細胞死亡，抑制細菌生長，誘導持留菌的形成，造成潛伏感染及提高細菌對環境壓力的耐受性。TAS的作用機制取決于病原菌在不同生活時期的生物學特性，當受到不良環境或刺激后，打破了毒素抗毒素之間的平衡，抵抗力強的毒素被激活，作用于胞內靶分子，引起抑菌或殺菌效應[19]。Sat等[20]對大腸桿菌進行mazEF基因敲除，通過比較其普通菌株和敲除株對不利環境如藥物的反應，發現藥物可以干擾或消耗不穩定的抗毒素，而使穩定的毒素MazF堆積，導致細菌的程序性死亡，因此推測mazEF可能是其程序性死亡進程中的關鍵因素。本研究通過敲除和過表達北京和非北京基因型菌株mazEF3、mazEF6和mazEF9基因后，觀察各菌株在不同環境下的生長曲線，結果顯示無論是北京還是非北京基因型菌株，其缺失突變株和過表達菌株的OD值均低于親本株，提示mazEF3,6,9與MTB生長繁殖相關。缺失后，mazEF3,6,9不能發揮其應有的調節細菌生長繁殖作用，尤其是在不利的環境條件下，導致MTB菌數下降。過表達mazEF3、mazEF6和mazEF9基因，MTB菌數也降低，推測雖然抗毒素可以中和毒素，但是抗毒素不穩定，易降解，導致毒素增多、引起菌體死亡，或者是由于菌體內其他調節因素也參與了對其過表達調節作用的結果。究竟是何種原因導致的這種現象，需要進一步探討。該結果也提示作者應進一步研究：在上述培養條件下，分別檢測mazE3、mazE6、mazE9、mazF3、mazF6和mazF9對北京和非北京基因型菌株生長繁殖的影響。在mazEF系統mRNA表達水平上，北京基因型與非北京基因型菌株相比，mazEF3高表達；mazF3、mazF6、mazF9均高表達；mazE9低表達，差異均具有統計學意義(P<0.05)。有研究表明，分枝桿菌中Rv1103c-1102c(mazEF3)、Rv1991a-1991c(mazEF6)和Rv2801a-2801c(mazEF9)屬于經典的TAS，其中mazEF6、mazEF9在營養匱乏環境中啟動子增強最顯著[21]。本研究結果顯示北京基因型比非北京基因型菌株的mazEF3基因轉錄水平高，兩者同為臨床致病菌，或許mazEF3高表達賦予了北京基因型菌株抗壓力強的特點，在入侵宿主時可以抵抗機體的不利環境而生存，這也許是造成其易流行、持留生存及出現耐藥菌性的原因之一。當MTB處于不利環境時或入侵宿主遭遇免疫系統攻擊時，接受細胞外死亡因子的刺激，細菌的TAS被激活，其中毒素性質穩定，而抗毒素性質不穩定易被蛋白水解酶水解，造成毒素累積，而北京基因型菌株毒素基因均高表達，可產生更多的毒素，可以選擇性的使一些細菌死亡，從而為剩余的細菌保留能量和營養物質，此為利他性死亡，以保證群體穩態和適應不利環境[22]。作為新疆主要流行株北京基因型菌株mazE9低表達，推測為是內在特定分子表達調節的結果，尤其是mazE9低表達和mazF9高表達的協同作用，能使更多的毒素累積進行利他性程序性死亡，從而提高自身對不良環境的耐受性，也許這也是成為流行株的原因之一。

Nariya[23]等人證實大量誘導表達MazF可使細胞處于停滯狀態，隨后大劑量誘導表達MazE可中和MazF的毒性，使細胞恢復活性。這一停滯狀體與結核分枝桿菌的休眠狀態很相似。當游離的MazF在細胞內時間或累計量超過某一界點時，就會導致細胞的死亡。我們推測毒素蛋白累積量不同可以使細胞表現出不同的狀態，當少量累計時提高細胞對不利生存環境的耐受，當環境進一步惡化，毒素持續累積，促使細胞進入休眠狀態，當毒素作用時間或者累積量達到某一值時細胞死亡。實驗中使用Western Blot技術檢測蛋白質水平的表達時，結果顯示，北京基因型菌株相對于非北京基因型菌株，MazF9蛋白高表達，與mazF9基因mRNA表達趨勢一致。在轉錄和翻譯水平上，mazF9的高表達也許是北京基因型菌株成為流行株、廣泛傳播的原因之一。

綜上所述，作者初步探索了北京及非北京基因型結核分枝桿菌的生長曲線、mazEF3,6,9系統表達有無差異以及mazEF系統是否與北京基因型菌株流行相關。研究結果表明，北京與非北京基因型結核分枝桿菌的生長曲線、mazEF3,6,9系統表達存在差異，mazEF系統與北京基因型菌株流行相關。MTB的染色體上存在著大量的TAS系統，mazEF3,6,9系統只是其中之一，mazEF3,6,9系統在MTB中究竟如何發揮作用以及與其他TAS系統、調節因素的互作用需要進一步研究。