基因芯片技術在快速診斷肺結核中的應用價值

2016年，全球估計有170萬患者死于結核病,約有新發結核病例1 040萬，其中半數集中在中國、印度等5個國家[1]。早期、快速、準確診斷結核，是結核防治的關鍵。

結核病的確診主要依靠病原學，傳統病原學檢測以抗酸染色及培養為主。抗酸染色簡便、價廉，是目前使用最廣的結核診斷方法，但陽性率不高，多在9.8%～35.5%[2-3]，且無法鑒別結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)與非結核分枝桿菌。本研究采用液基夾層杯涂片法檢測MTB，與直接抗酸染色相比，標本經消化、離心、濃縮等處理后，陽性率可提高至23.5%～66.67%[3-7]。MTB培養是診斷活動性肺結核的“金標準”，但周期長,羅氏培養至少需4～8周[8]，液體培養如BACTEC-MGIT 960系統雖耗時更短，仍需1～2周[9-10]，均難以滿足臨床需求，新的診斷技術亦應運而生。近年來，基因芯片技術逐漸廣泛應用于結核診斷，有研究報道基因芯片法診斷MTB的敏感性為82.3%～99.5%，特異度可達100%[11-13]。

本研究對648例疑似肺結核患者的臨床標本同時采用基因芯片法、改良羅氏培養法、液基夾層杯涂片法(以下分別簡稱“芯片法”、“培養法”、“夾層杯法”)進行MTB檢測，通過對3種方法的陽性率、敏感性、特異度等指標進行比較，評價基因芯片技術在快速診斷肺結核中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象 2016年2月-2017年9月重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸科住院的疑似肺結核患者648例，其中男性409例，女239例，年齡14～95歲，平均50±18.5歲。所有患者均進行胸部影像學檢查，同時留取體液標本，包括痰331例、支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)243例、胸水74例，同時送檢芯片法、培養法及夾層杯法檢測MTB。

1.1.2診斷標準及篩選結果 肺結核診斷標準參照《肺結核診斷標準 WS288-2008》[14]，非結核的其他肺部疾病診斷參照《臨床診療指南-呼吸病學分冊》[15]。648例患者，最終有435例診斷為肺結核，213例為非結核病(肺癌106例，社區獲得性肺炎48例，肺膿腫32例，支氣管擴張伴感染27例)。

1.1.3主要實驗儀器及試劑 夾層杯II，載玻片、自動離心涂片機、快速干片機、染色液，均購買于湖南天氣醫學新技術有限公司；改良羅氏培養基(中性)由貝索公司提供；普通PCR擴增儀，高速離心機，核酸提取儀，SlideWasherTM芯片洗干儀，BioMixerTMII芯片雜交儀。LuxScanTM10K/B微陣列芯片掃描儀、晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑盒以及試劑購于博奧生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1液基夾層杯涂片 取痰標本3～5 mL、胸水和BALF標本10～20 mL于夾層杯II,進行消化、震蕩、離心、烘干；加入染色劑，以60 ℃左右染色5 min，沖洗、瀝干；脫色；再次加入染色劑染色1～3 min,洗凈、瀝干。取出封片、鏡檢。讀片參照《肺結核診斷標準 WS288-2008》[14]。

1.2.2改良羅氏培養 痰標本3～5 mL進行消化、離心、濃縮；胸水和BALF標本10～20 mL以3 000 g離心、濃縮，均勻接種于培養基。將培養基水平置于37 ℃培養箱24 h后改豎直放置；于第3 d、7 d觀察細菌生長情況，以后每周觀察1次,連續8周。報告標準參照《肺結核診斷標準 WS288-2008》[14]。

1.2.3基因芯片檢測 標本內加入消化液，渦旋震蕩2 min，室溫液化60 min后離心。取1 mL液化后標本于1.5 mLEP離心管內，于沉淀內加入50～80 μL核酸提取液，并轉移到核酸提取管內震蕩5 min，后95 ℃金屬浴5 min，10 000 r/min離心1 min，提取核酸備用。將模板DNA和對照品2 μL分別加入PCR管行PCR擴增；將PCR產物在95 ℃下變性5 min、驟冷冰浴。以9 μL雜交緩沖液、6 μL PCR產物的比例制雜交混合物。取混合物13.5 μL加入芯片并密封雜交盒；放入芯片雜交儀以50 ℃、5 r/min雜交2 h。洗滌、甩干,于芯片掃描儀判讀結果。

結果判讀：在質控探針信號正常的情況下，若某一探針信噪比≥3，且其信號值≥其對應的臨界值，則該探針結果為陽性；否則為陰性。菌種鑒定結果根據探針陰陽性結果判斷，若只有1條探針為陽性結果，則表示待測樣品為該探針所對應的分枝桿菌種或群；若有1條以上探針為陽性結果，則通過組合來確定待測樣品所對應的分枝桿菌種或群。

1.3統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，用Kappa檢驗對不同方法檢測結果的一致性進行評價，即Kappa≥0.75，兩者一致性好；0.75>Kappa≥0.4，兩者一致性中等；Kappa<0.4，兩者一致性較低。所有結果均采用χ2檢驗進行差異性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.13種方法的陽性率 芯片法最高(58.30%)，其次為培養法(51.40%)，夾層杯法最低(36.70%)(見表1)。

表1 3種檢測方法的陽性檢出來
Tab.1 Positive rates of the 3 detection method

方法總 數(例)陽性數(例)陽性率(%)χ2P值芯片法64837858.306.310.012a培養法64833351.4028.25<0.05b夾層杯法64823836.7060.64<0.05c

注：a對比芯片法、培養法 ; b對比培養法與夾層杯法 ; c對比芯片法與夾層杯法。

2.23種方法的敏感度和特異度 以培養法為金標準，芯片法的敏感度、陽性預測值以及與培養法結果的一致性均高于夾層杯法，特異度較夾層杯法稍低(見表2)。

2.3與臨床診斷的比較 以臨床診斷結果為金標準，在非結核患者中，3種方法均無陽性結果，故特異度為100%，誤診率為0；芯片法與臨床診斷一致性較好；培養法一致性一般；夾層杯法一致性較低。芯片法敏感度高，漏診率低，特異度好，結果具有較高的準確性，見表3。

表2 芯片法及夾層杯法檢測結果與培養法的對比分析
Tab.2 Comparative analysis of results from the gene chip technique and Liquid-based interlayer vessel technique and Roche culture results

方法培養法敏感度/%特異度/%符合率/%PPV/%NPV/%KappaP值+-芯片法+3186095.58188.4384.1394.440.767<0.05-15255夾層杯法+2172165.293.378.8691.1871.70.623<0.05-116294

注：PPV是陽性預測值；NPV是陰性預測值。

表3 3種方法檢測結果與臨床診斷的對比分析
Tab.3 Comparison of test results and clinical diagnosis of the 3 methods

方法臨床診斷敏感度/%特異度/%誤診率/%漏診率/%符合率/%KappaP值+-芯片法+378086.90100013.1091.200.813<0.01-57213培養法+333076.60100023.4084.300.682<0.01-102213夾層杯法+238054.70100045.3069.600.443<0.01-197213

2.4不同標本的陽性率 3種標本使用芯片法檢測，陽性率最高為BALF 72.0%(175/243)，其次為痰54.4%(180/331)，胸水最低31.1%(23/74)；使用培養法陽性率由高到低依次為BALF 62.6%(152/243)，痰48.6%(161/331)，胸水 27%(20/74)；夾層杯法陽性率為BALF 51.8%(126/243)，痰30.8%(102/331)，胸水 13.5%(10/74)。差異均具有統計學意義 (見圖4)。

圖4 不同標本的陽性率對比分析Fig.4 Comparison of positive rates of different specimens

2.5胸水用不同方法檢測MTB的陽性率 使用芯片法、培養法、夾層杯法檢測胸水MTB，陽性率依次為31.1%(23/74)、27%(20/74)、13.5%(10/74)。芯片法高于夾層杯法，差異具有統計學意義(χ2=6.591，P<0.05)；芯片法陽性率高于培養法，但差異不具有統計學意義(χ2=0.295，P>0.05)(見表5)。

表5 胸水使用不同檢測方法陽性檢出率比較
Tab.5 Comparison of positive rates of pleural effusion using different detection methods

陽性率/%χ2值P值芯片法31.10(23/74)0.2950.587a培養法27(20/74)4.181<0.05b夾層杯法13.51(10/74)6.591<0.05c

注：a對比芯片法與培養法; b對比培養法與夾層杯法; c對比芯片法與夾層杯法。

3 討 論

基因芯片通過檢測固定于特殊載體上的多種探針與待測樣本核酸的雜交信號強度而獲取樣本信息[16]。由于MTB的16S rRNA和rpoB基因是具有種屬特異性的高度保守序列，故可直接將分枝桿菌鑒定到種[17]。該方法具有高通量、高效快捷(6 h)、靈敏度高、自動化等優勢[18]。2017年11月新發布的肺結核診斷標準[19]已增加分子生物學結果作為確診依據。本研究所使用的基因芯片能夠檢測出結核分枝桿菌(MTB)及包括鳥分枝桿菌、戈登分枝桿菌、胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等在內的常見的16個種、群的NTM，快速進行分枝桿菌菌種鑒定，為迅速診斷肺結核提供依據。

3種方法檢測MTB，以芯片法的陽性率最高(58.3%)，其次為培養法(51.4%)，夾層杯法最低(36.7%)；其中，芯片法陽性而培養陰性的患者共60例，這些患者均符合肺結核診斷標準[14],且抗結核治療后隨訪癥狀好轉和(或)病灶吸收。其芯片法陽性而培養陰性的原因，可能與標本類型有關。該60例標本中，以BALF和痰為主(31例BALF、21例痰、8例胸水)，且芯片法靈敏度高(1×103個菌/反應)，故芯片法陽性而羅氏培養陰性。

以培養法為標準，芯片法靈敏度(95.5%)、陰性預測值(94.44%)以及一致性均顯著高于夾層杯法(65.2%、71.7%)；但特異度(81%)較夾層杯法(93.3%)低，分析其原因，可能與基因芯片法能夠進一步將分支桿菌鑒定到種，區分NTM和MTB有關。

BALF、痰、胸水標本用同時使用3種方法檢測MTB，陽性率由高到低依次均為BALF、痰、胸水。提示MTB檢出率與標本類型有關。

BALF直接取自病變支氣管內或靠近病變區域，且檢查等機械刺激后，標本獲得MTB的機會增大，故陽性率高。常占平[20]等發現BALF快速培養陽性率(83.6%)顯著高于纖支鏡術后痰培養(57.2%)。尤其對于痰少、病灶局限、引流支氣管欠通暢、非活動性肺結核患者，使用BALF檢測MTB優勢明顯[21]。

痰MTB檢測陽性率不高，且易受到多種因素的干擾，標本質量、涂片技術以及讀片準確性等都可影響痰檢結果。宋紅煥[5]報道，膿性痰的陽性率(47.5%)高于非膿性痰(13.5%)。而增加送檢標本數可提高陽性檢出率[22]。

胸水是胸膜對MTB抗原的免疫反應所產生的，故MTB含量極少，加上胸水的稀釋、取材、送檢等影響，其涂片、培養陽性率均不高[23]，導致結核性胸膜炎確診困難。其直接涂片陽性率在10%左右[24],培養陽性率也僅15.9%～36.6%[25-26]。本研究同時上述3種方法檢測胸水MTB，陽性率依次為芯片法(31.1%)、培養法(27%)、夾層杯法(13.51%)。芯片法高于夾層杯法，差異有統計學意義；芯片法與培養法相比，雖然差異不具有統計學意義，但芯片法耗時(6 h)顯著低于培養法(4～8周)，且具準確率高、污染率低、生物安全性高等優勢，能夠早期、快速、準確診斷結核性胸膜炎。因此，建議考慮診斷結核性胸膜炎，送檢胸水行MTB檢測時，可優先選擇或同時送檢基因芯片法檢測，以輔助診斷。

綜上所述，基因芯片技術診斷肺結核的敏感度高、特異度好，準確性高，其對于胸水MTB檢測的陽性率并不低于培養法，且耗時顯著縮短，并能將分枝桿菌鑒定到種。能夠為早期、快速、準確診斷肺結核提供重要依據，具有良好的應用前景。此方法還可作為結核治療效果評價的指標，但尚需進一步的臨床試驗證實。