Hsp16.3在結核分枝桿菌潛伏感染中的作用

結核病(Tuberculosis，TB)主要是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)感染引起的慢性傳染性疾病。據世界衛生組織(WHO)估計，2014年新增約960萬例結核病例和150萬例死亡病例[1]。世界約有1/3的人口攜帶Mtb，其中90%的攜帶者處于潛伏感染狀態[2](latent TB infection, LTBI)，這是結核病復發的主要因素。在LTBI狀態下，Mtb可保持穩定但可逆的非復制狀態許多年，稱為休眠(dormant，D)。休眠型Mtb(D-Mtb)是導致潛伏性結核感染(LTBI)的主要原因[3-4]。此時，D-Mtb可在體外培養，并對嚴重缺氧或營養剝奪的不利存活條件具有抗性[5-6]。同時，休眠型桿菌可以調節自身代謝以適應宿主環境并干擾宿主免疫系統，進而持續存在于體內的機制仍不十分清楚。

巨噬細胞是阻止體內Mtb擴散的主要屏障，巨噬細胞自噬是對抗Mtb的重要免疫機制。 自噬途徑的啟動促進吞噬體的成熟以及與溶酶體的融合，最終導致細胞內Mtb被清除[7-8]。 最近的研究已證實，巨噬細胞內的Mtb可以通過調節其自身的基因表達來抑制吞噬體成熟和/或吞噬體-溶酶體融合，使其免受宿主免疫應答的清除，從而有利于其存活并導致適應性免疫和LTBI的建立[9]。 因此，潛伏感染的Mtb能夠逃避巨噬細胞的自噬[10]。

已經報道了幾種Mtb分泌蛋白有助于Mtb的持續性感染，其中之一是熱休克蛋白16.3(Heat Shock Protein 16.3, Hsp16.3，也稱為Rv2031c，HspX或Acr)，它們對于維持Mtb的穩定性和長期生存力具有重要作用。在LTBI中，Hsp16.3的高表達，表明其參與了Mtb休眠菌的形成[11]。在巨噬細胞或無氧環境中，Hsp16.3的表達量可增加至Mtb中總細菌蛋白的25%，使細胞增厚以防止宿主細胞誘導的免疫損傷[12-13]。因此，Hsp16.3可能通過一些途徑調節巨噬細胞的自噬功能，從而維持宿主細胞中Mtb的存活。本文我們將討論休眠細菌如何通過Hsp16.3調控自噬，從而逃逸巨噬細胞自噬體的作用，提示Hsp16.3有可能作為LTBI的潛在生物標志物和抗結核藥物的新靶點。

1 休眠的結核分枝桿菌和自噬

LTBI是產生陽性結核菌素試驗(PPD)的亞臨床狀態，但是其胸部X射線檢測無明顯的結核感染跡象[14]。在這種狀態下，休眠桿菌可以在宿主體內存活但不產生任何癥狀或體征，直至某些條件得到滿足，此時桿菌突然從休眠中復蘇，開始復制，最終導致結核病發生[9]。研究發現，在低氧環境中，Mtb會改變某些酶(如檸檬酸水解酶)的表達，從而改變其代謝途徑而進入休眠狀態[15]。作為對Mtb感染的主要屏障，活化的巨噬細胞釋放有毒的活性氧和氮來直接殺死Mtb，而自噬則對胞內病原體的清除發揮了重要作用[16]。Cheallaigh等[10]證實巨噬細胞通過增加自噬體成熟及自噬體-溶酶體融合來啟動細胞自噬以除去感染細菌。Gutierrez等[17]和Amano等[18]發現自噬與巨噬細胞中Mtb的活性密切相關。此外，自噬促進樹突狀細胞(DC)的成熟，并刺激適應性免疫應答以除去細胞內的細菌[19]。當用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)和針對beclin-1的siRNA(atg6)一起處理DC或巨噬細胞時，2種細胞的抗原呈遞能力均顯著降低，自噬發生減弱。這增加了細胞內分枝桿菌的生存能力，并降低了它們的清除率，使之持續感染[20]。因此，LTBI與巨噬細胞自噬密切相關。這種關系存在的潛在原因包括： 1)休眠菌可阻止吞噬體成熟及吞噬體-溶酶體融合; 2)Mtb改變了巨噬細胞自噬相關基因的表達以阻礙病原體向溶酶體的輸送并防止溶酶體降解。這使得Mtb能夠存活、復制并最終從巨噬細胞逃脫[16]。

2 Hsp16.3和LTBI

Hsp16.3是α-晶狀蛋白型熱休克蛋白，由144個氨基酸組成，分子量約為16.3 kDa。α-晶狀蛋白結構域是位于C-末端的90～100個氨基酸殘基[21]，它是Mtb免疫原性最強的潛伏相關抗原之一。敲除實驗顯示Hsp16.3是巨噬細胞中Mtb復制的關鍵因子[22]。當Mtb在低氧條件下培養或在巨噬細胞中生長時，Hsp16.3的表達被上調[23]。acr基因的缺失明顯減弱了Mtb的毒力，并顯著削弱了其在小鼠骨髓衍生的巨噬細胞和THP-1巨噬細胞中的生長[24]，這表明Hsp16.3的表達提高了Mtb在巨噬細胞中的生存能力。體外研究顯示，在LTBI中，Mtb增加了編碼Hsp16.3的DosR(休眠存活調節基因)，特別是Rv2031c的表達[25]。根據其在先天性和適應性免疫反應中的重要功能，Hsps被認為是結核病理想的生物標志物[26]，特別是Hsp16.3與Mtb休眠狀態有關。

高水平的Th1細胞因子和ROS可促進Mtb感染的巨噬細胞的自噬[27]。在Mtb感染的早期階段，Hsp16.3分泌誘導巨噬細胞產生IFN-γ以清除Mtb[21]。然而，在豚鼠實驗中，基于Rv2031c的疫苗接種顯示通過增強的IL-12，IL-10和TGF-β的產生來提供對抗結核的保護作用[28]。在LTBI期間，Rv2031c可誘導產生高水平的IL-10[29]，IL-10和TGF-β通過抑制T細胞產生IFN-γ，阻斷或抑制巨噬細胞活化和凋亡，從而使Mtb在巨噬細胞中存活。已有實驗證實宿主中IL-10的增加與細菌抗性的降低相關[30]。肺泡巨噬細胞、單核細胞衍生的巨噬細胞或THP-1細胞在感染了野生型或Mtb減毒株后，用抗IL-10抗體進行處理，顯著促進吞噬體成熟[31]。IL-10主要是通過激活轉錄因子3(STAT3)途徑抑制自噬體的成熟，這與報道的STAT3參與IL-10介導下調宿主的炎性反應相一致[32]。圖1顯示了我們推測在LTBI中Hsp16.3干擾巨噬細胞自噬的作用模式。

圖1 Hsp16.3可能參與Mtb感染中抑制巨噬細胞自噬的信號通路Fig.1 The signaling pathway of Hsp16.3 inhibiting autophagy in macrophages in Mtb infection

一些研究揭示了α-晶體蛋白在調節細胞活力和保護中樞神經系統中的作用，該蛋白可直接作用于線粒體以減少氧化應激[33]。據報道，細胞外α-晶體蛋白通過激活MAPK / PI3K / Akt信號通路，并阻斷線粒體釋放ROS來保護星形膠質細胞[34]。因此，Hsp16.3可以通過活化抑制自噬的信號傳導途徑來調節ROS的產生。然而，細胞因子與Hsp16.3之間是否存在明確的聯系，以及Hsp16.3影響細胞因子產生的機制還需要進一步的研究。

在LTBI中，Hsp16.3通過IL-10的產生，一方面抑制T細胞產生IFN-γ，抑制巨噬細胞活化，同時IL-10通過激活STAT3途徑抑制自噬體的成熟和ROS的產生抑制自噬的發生。

近期的研究中報道，通過評估小鼠巨噬細胞RAW264.7中LC3II免疫熒光斑點的表達，觀察了Mtb中Hsp16.3基因缺失(Hsp16.3ΔMTB)對巨噬細胞自噬的影響[35]。結果顯示Hsp16.3缺失促進了巨噬細胞中自噬的形成，支持了Hsp16.3抑制LTBI中的巨噬細胞自噬的假說。為了證實Hsp16.3ΔMTB誘導自噬的發生而不是抑制自噬降解，將巨噬細胞在巴弗洛霉素A1(BAF)處理后用Hsp16.3ΔMTB感染。此時，LC3 II的表達高于未用BAF處理的Hsp16.3ΔMTB感染的細胞。此外，通過形態觀察和計算分析了RAW 264.7細胞吞噬的Hsp16.3ΔMTB的CFU。結果顯示Hsp16.3ΔMTB感染用雷帕霉素處理的巨噬細胞，只存活少量的Mtb，而用3-MA抑制劑和BAF處理的巨噬細胞可觀察到更多的Mtb。這些結果表明LC3II斑點的積累可以被解釋為自噬增加而不是自噬成熟的抑制[35]。

3 Hsp16.3是LTBI的潛在生物標志物

由于結核病復發率高，因此迫切需要及時、準確地檢測和診斷LTBI。盡管結核菌素皮膚試驗是傳統的檢測方法，但其診斷LTBI的能力有限，并且在接種BCG的個體中受到高假陽性率的困擾[36]。基于T細胞的IFN-γ釋放試驗(IFN-g release assay，IGRA)更廣泛地用于LTBI的檢測，但由于其不能區分LTBI與活動性TB，所以仍然需要高靈敏度和特異性的免疫標記物。我們嘗試制備了Mtb分泌蛋白(ESAT6，CFP10，Ag85B，Hsp16.3)和融合蛋白Ag85B-Hsp16.3，通過ELISA檢測針對這4種分泌蛋白的IgG血清抗體，在活動性結核患者和LTBI患者中評估確認感染的能力[37]。結果顯示：Ag85B-Hsp16.3 / ESAT6和Hsp16.3 / ESAT6是活性TB和LTBI個體血清學診斷的最佳關聯抗原，ELISA檢測結果顯示41.67%(25/60)獻血員對Ag85B-Hsp16.3 / ESAT6有反應。這種陽性反應與臨床診斷的一致性幾乎達到84%。提示基于Hsp16.3的多種Mtb分泌蛋白Ag85B和ESAT6的聯合檢測可能是區分活動性TB和LTBI患者的有效篩選抗原。

Hsp16.3不僅與宿主內Mtb的穩定性相關，而且含有多個人T細胞和B細胞表位[38-39]；如其～p91-p110，～p21-p29和～p120-p128多肽表位都能夠活化CD4+T細胞和CD8+T細胞，通過分泌IFN-γ清除Mtb的感染[40]。Belay等人[29]在LTBI患者中發現針對Rv2031c誘導高水平的TNF-α和IL-10。這提示針對Rv2031c的TNF-α和IL-10拮抗劑可能是LTBI患者保護性免疫的潛在生物標志物。因此，Hsp16.3可作為活動性結核病和LTBI患者診斷的輔助指標[37]，對高危患者的結核病篩查和早期診斷具有重要意義。

4 展 望

除了作為一個潛在的診斷標志物，HspX還能在應激條件下(包括休眠狀態)通過調節參與宿主代謝的關鍵酶來適應宿主環境，從而維持Mtb蛋白的穩定性[41]。Hsp16.3的分子伴侶活性依賴于N-末端的結構和C-末端的α-晶狀體蛋白結構域[42]。在晶狀體結構域的疏水表面和在N-端區域的疏水殘基具有底物分子的主要結合位點，如熒光素酶(Luc)、檸檬酸合成酶和蘋果酸脫氫酶(MDH)等[43-44]。這些酶可能會影響休眠菌和宿主之間的相互作用，或是改變Hsp16.3的結構抑制細菌生長[22]。進一步研究，以探索Mtb通過Hsp16.3抑制宿主細胞自噬發生的特定分子信號通路和相關的調控分子，可能會發現新的結核病候選藥物和潛在的LTBI生物標志物，有助于控制LTBI的發生。