土壤DNA提取技術在本科教學實驗教學中的應用

李亮　武洪慶　郭子渝　崔忠信　胡海誠

摘 要 開展科研訓練、提高學生科學素養，一直是本科教學改革研究熱點之一。以課題組常用的實驗技術“土壤DNA提取”為基礎，結合“大學生科技創新”等活動，設計綜合創新實驗，對可能參與課題組科研工作的學生進行選拔和培訓。綜合創新實驗提高了學生的科研能力、訓練了學生的科研思維，使學生順利的參與到教師的科研工作中，實現了教學與科研的相互融合。

關鍵詞 微生物DNA提取 教學與科研融合 創新

中圖分類號：G424 文獻標識碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdks.2019.06.056

Application of Soil DNA Extraction Technology in

Undergraduate Teaching Experiment

LI Liang， WU Hongqing， GUO Ziyu， CUI Zhongxin， HU Haicheng

（College of Chemical Engineering and Technology， Hebei University of Technology， Tianjin 300130）

Abstract Developing scientific research training and improving students' scientific literacy has always been one of the hotspots in undergraduate teaching reform. Based on the experimental technology "soil DNA extraction" commonly used by the research group and combined with the activities of "scientific and technological innovation of College students"， comprehensive innovation experiments were designed to select and train students who might participate in the research work of the research group. Comprehensive innovation experiment improves students' scientific research ability， trains students' scientific research thinking， makes students participate in teachers' scientific research work smoothly， and realizes the integration of teaching and scientific research.

Keywords microbial DNA extraction； integration of teaching and scientific research； innovation

在本科生的培養過程中，實驗教學具有重要的意義。傳統的實驗教學可以在預期的時間內實現學習基本實驗方法、規范基本實驗操作、檢驗某一理論或原理等目的。然而，這只是一種基礎普眾性教學，處于實驗教學的初級階段。其“實驗設計能力缺失”“與科研結合不緊密”“學生動腦少、缺乏主動性”等缺點使傳統實驗教學方法遠遠達不到培養具備高水平實驗技能優秀人才的目的。近年來，很多高校開展實驗教學改革，構建了“基礎規范實驗”“綜合設計型實驗”“研究探索（創新、開放）型實驗”相結合的新模式，[1-2]同時將實驗教學與“大學生科研訓練計劃”、[3]大學生科技創新”等活動有機結合，使學生完成“從依附性到相對獨立性的轉變、從被動性到相對主動性的轉變”，提高學生的綜合實驗能力，從而更加有利于拔尖創新人才的培養。

本課題組多年來致力于土壤污染微生物修復研究，[4]積極將以一些科研成果轉化為綜合型、設計型、創新型的實驗，這類實驗既能有效培養學生的科學素養，提高了學生參與科學研究的興趣。同時，作為學生參與課題組科研工作前的培訓，可以使學生熟悉課題組的基本工作，實現從學習性的基礎實驗教學到創新性的科研訓練之間的無縫銜接和過渡。

本實驗通過特定土壤樣品DNA提取方法的選擇和優化實驗，鍛煉了學生的實驗技能，培養了學生實驗方案選擇和設計能力，完成學生實驗由被動到主動的轉變。在實驗的過程中，學生文獻檢索、實數據處理、結果分析、總結和歸納的能力也得到了訓練，從而為學生進入實驗室參與科研工作奠定了初步基礎。

1 教學設計

本專業學生可以根據自己的興趣申請，利用課余時間參與課題組科研項目的實施。實驗從文獻查詢、方案設計到結果分析均由學生自行完成；教師只對學生錯誤的實驗操作進行糾正，并提供必要的引導。實驗通過配制不同功能的試劑和洗脫劑，配制高效的土壤腐殖酸吸附劑，優化納米TiO2和活性炭的比例，完成從土壤環境中獲取微生物懸液，去除冗余雜質，獲得粗制DNA、精制DNA的過程，并對最終獲得的DNA進行濃度及純度的檢測。

2 實驗方法

2.1 土壤樣品

土壤樣品取自于天津市靜海區普通小麥田，農田土壤類型均為褐土，采樣深度為表層土下10～20 cm，按5點取樣法， -20℃保存。

2.2 土壤總DNA的提取

方法1：采用Mo Bio公司的土壤DNA提取試劑盒Power Soil DNA Isolation Kit，參照說明書提取。

方法2：凍融法提取土壤DNA，具體方法參見參考文獻。[5]用70%乙醇洗沉淀，沉淀溶解于TE緩沖液，終體積50 L。

方法3：創新性配置腐殖酸吸附劑2 ml（0.2 mol/L納米TiO2；0.1% 活性炭）混合充分震蕩1 min；之后操作參考文獻[6]并加以改進。最終用冷的70%乙醇洗滌沉淀2次，用TE緩沖液溶解沉淀，最終體積為50 L。

2.3 DNA濃度和純度的檢測

采用紫外分光光度法分別測定粗制DNA溶液的光密度值OD260，OD230， OD280，根據公式：[dsDNA]=50譕D260紫∈捅妒撲鉊NA的濃度（單位為 g/mL），換算出每克干土提取DNA的量，根據OD230/OD260，OD260/OD280估算DNA的純度。

2.4 PCR

采用細菌16S rDNA基因的通用引物進行擴增，擴增后得到250 bp左右的片段。

3 實驗結果

3.1 土壤總DNA的提取和檢測

本研究所提取的土壤DNA經核酸蛋白測定儀檢測，其濃度依次為每克土壤10.4～13.8 g、15.6～20.7 g、24.9～30.8 g，其中方法3土壤DNA提取得率最高（表1）。

DNA樣品的純度使用OD260/OD280和OD260/OD230兩個指標檢測，從表1可以看出，降低蛋白質污染的效果方法3（1.645～1.814）優于方法1（1.545～1.731）和方法2（1.548～1.666）；降低腐殖質污染的效果方法3（1.82～2.19）和方法1（1.71～2.50）相近，優于方法2（1.66～1.71）。

表1 土壤總DNA的提取量和純度

3.2 PCR擴增結果

三種方法的瓊脂糖凝膠電泳效果見圖1。方法3所得的DNA濃度較高。對所得的DNA 進行16S DNA 擴增（圖2），方法3所得的DNA條帶清晰、明亮，說明擴增產物濃度較高，DNA模板獲得有效擴增。

綜合以上結果，方法3提取的DNA在濃度上有較大提高，DNA純度無明顯變化。考慮到學生實驗試劑使用劑量上的變化，優先選用方法3，其DNA提取效率較高，經濟合算。

4 結語

將課題組科研實踐中常用的基礎實驗技術改造成適合本科生的實驗內容，開設“土壤微生物高質量DNA提取實驗”這一綜合創新實驗，旨在使學生掌握基本的實驗操作，培育學生科研工作自主性。通過實驗過程中的不斷摸索，學生不但掌握土壤DNA提取技術的原理和操作要點，極大的提高了解決具體問題的能力，團隊合作的意識也得到了進一步加強。以創新實驗等形式作為學生參與科研實踐的序曲，不僅能使學生順利的融入課題組，更能夠在自主的實驗過程中訓練學生的科研思維、培養學生嚴謹的科研素養，從而提高了本科人才培養的質量，促進了教學與科研的相互融合。

*通訊作者：李亮

基金項目：河北省高等學校科學技術研究青年基金（QN2018014）；國家自然科學基金 （31801948）；“河北工業大學大學生創新創業訓練計劃”項目（201810080013）

參考文獻

[1] 陸國棟，李飛，趙津婷等.探究型實驗的思路、模式與路徑——基于浙江大學的探索與實踐[J]. 高等工程教育研究，2015（03）：86-93.

[2] 薛雅蓉，劉常宏.細胞生物學“半開放設計性實驗”教學的意義與實施方法[J].實驗技術與管理，2013.30（08）：167-170.

[3] 蒲賢潔， 歐增福， 韓忠等.基于開放實驗室的大學生科研訓練項目實例[J]. 實驗技術與管理， 2017（03）： 237-241，256.

[4] Li L， Li L， Wang X， et al. Plant growth-promoting endophyte Piriformospora indica alleviates salinity stress in Medicago truncatula[J]. Plant Physiology & Biochemistry Ppb， 2017. 119： 211.

[5] Tsai YL， Olson BH. Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments[J]. Applied & Environmental Microbiology， 1991. 57（4）： 1070.

[6] Zhou J， Bruns MA， Tiedje JM. DNA recovery from soils of diverse composition[J]. Appl Environ Microbiol， 1996. 62（2）： 316-322.