鋁對蠶豆葉綠素熒光和葉綠素含量影響探討

張慧敏，劉東華

(1.山西省大同云岡區園林管理處，山西 大同 037006；2.天津師范大學，天津 300074)

1 引言

自然界中鋁分布極廣，地殼中的鋁含量為7.35%，僅次于氧和硅。鋁在自然界的化學性質十分活潑，鋁離子存在狀態與溶液pH值密切相關。在pH<5.0的酸性水體中，水溶性鋁是植物重要的生長限制因子。隨著酸雨沉降和酸性肥料的施用，土壤酸化加劇，鋁溶出量增加，環境中活性鋁成為酸性土壤中影響植物生長發育的重要因素。酸性土壤危害糧食作物減產，因此，改良酸性土壤，提高作物產量，是當前亟待解決的一項重要任務。

葉綠素熒光動力學技術可快速、無損傷的反映葉片光合功能內在特征。植物長期處于不良環境中，會出現葉綠素含量降低，光合作用速率下降等癥狀，進而表現為熒光參數發生變化。鋁處理可抑制玉米和大豆葉片葉綠素的合成，降低了大豆葉片葉綠素含量，葉片葉綠素a/b含量比也有一定下降趨勢，光合速率和蒸騰速率下降。Al3+毒害引起的葉綠素總量下降，可能是金屬離子抑制葉綠素酸酯還原酶的活性，從而影響葉綠素的合成。同時，Al3+還可與Mg2+競爭根表質膜上載體的結合點與吸收點，從而抑制植物對Mg2+的吸收，降低植物體內Mg2+的含量來影響植物葉片葉綠素總含量。鋁脅迫下，油菜葉綠素熒光參數隨著鋁濃度的增加而降低。常綠楊的鋁脅迫實驗發現，植株的光合效率，生長量和生物量都受到影響，并且觀察到葉肉細胞超微結構損傷程度與葉綠素熒光參數和植株生長量趨勢一致。煙草在鋁脅迫作用下，葉片的葉綠素含量和凈光合速率等熒光參數顯著降低。可見鋁脅迫對植物葉片的光合作用產生了一定的抑制，光合參數則在一定程度上反映出鋁脅迫對植物體的損傷情況。本實驗選取蠶豆作為實驗材料，觀察不同濃度Al3+脅迫下對蠶豆幼苗生長發育的影響，研究葉綠素熒光參數及葉綠素含量變化，探討Al3+對蠶豆光合作用影響的各個可能的因素及其能量耗散途徑，為進一步了解Al3+脅迫對蠶豆生理機制提供參考。

2 實驗方法

2.1 蠶豆幼苗的培養及Al3+脅迫

選取大小均一飽滿的蠶豆300粒，自來水浸泡2 d，待種子露白后，置于黑暗條件下生根。根長約2～3 cm 時用蒸餾水培養，并移至陽光充足的地方生長。待蠶豆幼苗的第一對葉片完全展開，第二對葉片剛生長時，移入配制的不同濃度Al3+(10 μM、50 μM、100 μM)的Hoagland營養液中生長，Al3+以硫酸鋁(Al2(SO4)3·化學純)的形式提供，對照組幼苗生長在Hoagland營養液。用NaOH和HCl調節溶液pH值，使其控制在5.5。每盆20株，營養液用氣泵持續通氣。每天觀察處理期間蠶豆的生長情況，每隔5 d更換處理液。

2.2 光合色素含量的測定(Lichtenthaler比色法 單位：mg/g)

蠶豆經Al3+處理3 d、6 d、9 d后，選取5株蠶豆植株相同位置上的葉片(第二對)，稱量記錄鮮重，研磨，丙酮浸提。次日早上進行離心(4000×g 20 min)，測定其吸光度A663、A646 ，A470，根據以下公式計算葉綠素a，葉綠素b含量。葉綠素a、b含量的測定方法參照張志良主編《植物生理學實驗指導方法》方法進行測定。①葉綠素a含量(mg/g)=2×10×10-3×(12.21×A663-2.81×A646)/FW；②葉綠素b含量(mg/g)=2×10×10-3×(20.13×A646-5.03×A663)/FW。

2.3 葉綠素熒光的測定

蠶豆經Al3+處理3 d、 6 d、 9 d后，用LI-COR 公司生產的LI-6400 配套的熒光葉室，測定蠶豆相同葉位(第二對葉片)的葉綠素熒光參數，初始熒光(Fo)，最大熒光(Fm)，光系統Ⅱ(PS Ⅱ)潛在光化學效率(Fv/Fm)，開放的PS II反應中心的激發能捕獲效率(Fv′/ Fm′)，PS Ⅱ實際的電子傳遞的量子效率(ETR)，非光化學猝滅參數(qN)。每組測5株幼苗。

2.4 數據統計方法

采用Sigmaplot 8.02軟件處理所有數據，統計并作圖，選用平均值和標準方差進行統計分析，使用 SPSS 13.0 對數據進行差異性分析。

3 結果與分析

3.1 Al3+脅迫對蠶豆株高和根長的影響

實驗過程中，對照組幼苗株高生長良好，莖桿粗壯，葉片呈綠色。如圖1所示，Al3+處理3 d后，Al3+處理組幼苗株高生長與對照組幼苗株高沒有明顯差異。但隨著Al3+處理時間的延長，幼苗株高生長逐漸受到抑制。10 μM和50 μM Al3+處理6 d 后，兩組幼苗株高低于對照組，但差異不顯著；而100 μM Al3+處理組幼苗株高顯著低于對照組(P<0.05)。Al3+處理9 d后，10 μM、50 μM和100 μM Al3+處理組的幼苗株高均顯著低于對照組(P<0.05)，各Al3+處理組之間的幼苗株高沒有顯著差異。因此，Al3+對蠶豆幼苗生長的抑制隨時間延長和濃度的增加，其抑制作用越明顯。但不同Al3+處理組幼苗的葉片均沒有出現毒害癥狀。

圖1 不同濃度Al3+處理對蠶豆株高的影響(n=10)

整個實驗過程中，對照組根生長良好，主根粗壯，側根發達，根系繁茂呈白色。與對照組相比，10 μM Al3+處理組的幼苗側根生長減少，根系顏色呈微褐色；隨著處理時間的延長，6 d后根生長與對照組差異顯著。在50 μM Al3+處理組中，根長及生長量低于對照組，根系顏色呈棕色，根尖膨大，有螺紋狀裂紋。100 μM Al3+處理組主、側根短且易斷，卷曲呈魚鉤狀，側根稀少，根系呈黑褐色，根螺紋現象加重。

圖2顯示了不同Al3+濃度處理對蠶豆根生長的影響。10 μM Al3+處理6 d后，其根生長與對照組根長相比有顯著差異(P<0.05)。50 μM 和100 μM Al3+處理組的根生長，在實驗過程中均顯著低于對照組。在Al3+處理的3個組合中，隨著Al3+濃度的升高，對根生長的抑制作用越明顯，其中100 μM Al3+處理組幼苗根生長量最少。

3.2 Al3+脅迫對葉綠素熒光參數的影響

Fv/Fm表示PSⅡ最大光化學量子產量，反映PSⅡ反應中心的最大光能轉換效率，通常在葉暗適應20 min后測得。整個實驗中，對照組及鋁處理組葉片的Fv/Fm值無顯著性差異(P>0.05)。各Al3+處理組與對照組葉片的Fv/Fm值在0.80～0.83之間，屬正常范圍(表1)。

圖2 不同濃度Al3+處理對蠶豆根長的影響(n=10)

Fv′/Fm′是PSⅡ實際光化學效率，它反映開放的PSⅡ反應中心原初光能捕獲效率。100 μM Al3+處理3 d的蠶豆幼苗葉片中Fv′/Fm′值降低，與對照組及10 μM、50 μM處理組相比差異顯著(P<0.05)。6 d后，盡管各Al3+處理組與對照組的Fv′/Fm′值無顯著差異(P>0.05)，但Al3+處理組Fv′/Fm′值低于對照組。50 μM 和100 μM Al3+處理9 d后，幼苗葉片中的Fv′/Fm′值比對照組顯著降低(P<0.05)。

ΦPSⅡ為光合電子傳遞量子效率，表示PSⅡ實際光化學量子產量，它反映PSⅡ反應中心在有部分關閉情況下的實際原初光能捕獲效率。ETR表示表觀光合電子傳遞速率，與光合作用過程中光反應電子傳遞有關。實驗中，不同濃度Al3+處理后蠶豆幼苗葉片ΦPSⅡ和ETR參數的變化趨勢一致。10 μM 處理組與對照相比無明顯差異(P>0.05)。50 μM Al3+處理6 d后，幼苗葉片的ΦPSⅡ和ETR值下降，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。實驗過程中，100 μM Al3+處理的幼苗葉片，ΦPSⅡ和ETR值始終顯著低于對照(P<0.05)。

qN代表非光化學淬滅，反映的是PSⅡ天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的光能部分。表1顯示了Al3+對蠶豆幼苗葉片的qN影響中，各處理組的非光化學淬滅系數qN都呈增長趨勢。相同處理時間內，蠶豆幼苗葉片的qN隨Al3+濃度增加而上升。在100 μM Al3+處理下，qN值顯著高于對照組(P<0.05)。50 μM Al3+處理3～6 d的葉片與對照組相比，qN值顯著增加(P<0.05)。10 μM 處理組與對照相比無明顯差異(P>0.05)。

3.3 Al3+脅迫對葉綠素含量的影響

Al3+脅迫下，蠶豆幼苗葉片光合色素含量的變化如表2所示。結果表明，實驗過程中，各Al3+處理組的葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)含量以及葉綠素a+b含量與對照組相比無明顯差異(P>0.05)。

從表2可以看出，50 μM和100 μM Al3+處理3 d后的蠶豆幼苗葉片Chla/b與對照組相比，顯著降低(P<0.05)。實驗中Al3+處理6 d后，3個處理組與對照相比，其蠶豆幼苗葉片Chla/b值下降，但無明顯差異(P>0.05)。處理9 d后100 μM Al3+處理組Chla/b明顯下降(P<0.05)。據以上結果分析，Al3+處理使蠶豆幼苗葉片光合色素含量下降，高濃度Al3+(100 μM)處理組Chla/b明顯降低。

表1 不同濃度Al3+對蠶豆葉片葉綠素熒光參數的影響

注：不同字母表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著(P<0.05)，平均值±標準誤差，n=3

表2 不同濃度Al3+處理對蠶豆葉片光合色素含量的影響

注：不同字母表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著(P<0.05)，平均值±標準誤差，n=3

4 討論

4.1 Al3+脅迫對蠶豆幼苗生長的影響

本實驗結果表明，不同濃度Al3+對蠶豆幼苗生長發育有明顯的影響，其中，最明顯的毒害特征是抑制株高和根生長。結果顯示，Al3+脅迫蠶豆幼苗9 d 后，10 μM和50 μM Al3+處理組的株高顯著低于對照組；在整個實驗過程中，100 μM Al3+處理下蠶豆植株株高生長受到明顯抑制。在根中，10 μM Al3+處理6 d后，幼苗根生長才受到抑制，而50 μM和100 μM Al3+脅迫下，植株根長受到明顯抑制。鋁抑制植物幼苗生長的結果與多數學者研究結果一致。一般認為，由于根系直接接觸鋁溶液，因此最先受到毒害。水稻在鋁脅迫下，地上部分和根的鮮重顯著下降。增加Al3+濃度和延長處理時間，小麥幼苗地上部分的高度趨于下降，小麥根生長受到顯著抑制。植物根系是吸收和積累鋁的主要器官。松苗根部的鋁含量約是地上部分的4～9倍，轉移到地上部分的鋁很少。酸性條件下增加Al3+濃度和處理時間，植物根短粗，根尖膨大，彎曲成鉤狀，根系體積下降，根部細胞結構與功能受到破壞，影響植物水分吸收，營養元素的吸收運輸也受抑制，使幼苗生長受到阻礙。我們的結果顯示，Al3+脅迫對植物葉片形態和葉片顏色影響不明顯，葉綠素含量變化沒有差異，說明鋁主要積累在植物根部，向地上部分器官轉運較少，因而對植物莖葉的毒害較輕。

4.2 Al3+脅迫對葉綠素熒光參數和葉綠素含量的影響

葉綠素熒光參數可以反映葉片光合功能內在特征。相對于無脅迫條件，植物長期處于不良環境中，會出現葉綠素含量降低，光合作用速率下降等癥狀。隨著不利條件出現，熒光參數變化可作為外界脅迫及不利因素征兆的指示值。實驗結果中，不同濃度Al3+處理對蠶豆幼苗葉片Fv/Fm比值影響不大，且各處理組與對照組無顯著性差異。但是，Fv/Fm比值的測得相對滯后于脅迫引起的變化，同時Fv/Fm 不能顯示PSⅡ中活性中心與非活性中心的反應信息。因而Al3+脅迫下蠶豆PSⅡ的影響還需分析其他參數。

實驗結果中10 μM和50 μM Al3+下蠶豆幼苗Fv′/Fm′、ΦPSⅡ和ETR參數變化不大；100 μM Al3+處理的Fv′/Fm′、ΦPSⅡ和ETR參數均顯著降低，而qN值上升。這表明高濃度Al3+脅迫對蠶豆葉片PSⅡ的光能轉換效率、實際光化學效率及電子傳遞效率影響明顯。葉綠素作為光合作用中最重要的色素，在光合作用中發揮吸收、傳遞和轉化光能的重要作用，其含量高低與光合作用密切相關。葉綠素含量結果顯示，100 μM Al3+對蠶豆光合色素Chl a/Chl b比值降低，表明高濃度Al3+脅迫導致蠶豆幼苗葉片光合色素捕獲及轉化光能的能力下降，不利于光合作用的正常進行。植物葉片PSⅡ原初光能轉換效率降低，可能是葉片PSⅡ活性中心受損，光合作用原初反應過程受抑制。100 μM Al3+脅迫下蠶豆的ETR參數下降表明光合電子傳遞受阻導致，而PS II反應中心天線色素吸收的過量光能通過熱能耗散，因而非光化學淬滅系數qN上升。所以非光化學熒光碎滅是一種自我保護機制，對光合機構起一定的保護作用。