犢牛大腸桿菌病的診斷與防治

高晶萍 李珮瑤 王存連 張瑞華 范玉堂 程智慧 徐彤

摘? 要：目的：確定內蒙古某奶牛場初生犢牛發生腹瀉并導致嚴重死亡的病因，以便針對性采取有效的防控措施。方法：采集發病死亡犢牛的肺、肝、腎、脾、淋巴以及小腸，無菌操作進行細菌分離鑒定;分離菌株純培養后進行動物致病性試驗和藥敏試驗。結果：在送檢3例犢牛肝臟、脾臟及小腸接種培養基上，具有大腸桿菌菌落的典型特征，生化鑒定為大腸桿菌;在1例犢牛肺接種培養基上分離1株符合綠膿桿菌的菌落特征，生化鑒定為綠膿桿菌。致病性試驗顯示，大腸桿菌肉湯培養物接種小鼠腹腔后24h內全部死亡;綠膿桿菌菌株肉湯培養物也導致接種小鼠在48h死亡。藥敏試驗結果顯示，大腸桿菌對阿米卡星、頭孢哌酮和頭孢吡肟敏感;對諾氟沙星、慶大霉素、復方新諾明、新霉素、妥布霉素、環丙沙星耐藥;綠膿桿菌對頭孢吡肟、諾氟沙星、妥布霉素、慶大霉素和頭孢哌酮敏感，對復方新諾明、新霉素、妥布霉素、環丙沙星耐藥。結論：大腸桿菌是引起該場犢牛腹瀉死亡的主要病原菌，在抵抗力下降的情況下，部分犢牛繼發感染了綠膿桿菌，也是導致死亡的原因之一。

關鍵詞：犢牛腹瀉;大腸桿菌;分離鑒定;藥敏試驗;防治

中圖分類號 S858.23 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）11-0085-3

犢牛腹瀉是犢牛常發的一種胃腸疾病，發病原因有病原性感染和營養因素等。大多數犢牛腹瀉主要發生于犢牛出生后2周內，但在環境條件較差時，3～4周齡也仍然具有較高的易感性。在傳染性因素中，大腸桿菌是引起犢牛腹瀉的一種主要致病菌。臨床表現為腹瀉、脫水，嚴重者因機體脫水、酸中毒死亡。大腸桿菌的發病率和死亡率，因飼養管理水平、環境衛生的不同，具有較大的差異[1-2]。犢牛腹瀉一般在氣溫驟降及陰雨連綿的時期多發，任何降低犢牛抵抗力的因素都會導致本病的發生[3]。近年來，隨著我國養牛業集約化程度的提高，犢牛大腸桿菌病的發病率日趨增加，給養牛業帶來了巨大的威脅。

2019年2月份，內蒙古某奶牛場飼養的犢牛發生腹瀉，引起大量的死亡，根據流行病學和臨床癥狀懷疑為大腸桿菌，用慶大霉素、氟苯尼考和恩諾沙星等藥物后治療無效。為了進一步確診病因，采集發病死亡犢牛的肺、肝、腎、脾、淋巴、小腸等到河北北方學院進行了實驗室診斷，為臨床合理防控提供理論依據。

1 材料

1.1 病料來源 內蒙古某規模養殖場飼養奶牛約900余頭，采用集中發情和配種方式繁殖。2018年11月至2019年1月，在其1號和3號養殖棚內出生犢牛陸續發生腹瀉，用氨芐西林鈉與慶大霉素、氟苯尼考及恩諾沙星等進行治療，有效控制了此次犢牛腹瀉。然而，2019年2月初，該場2號棚陸續出生250余頭犢牛，出生不久后，部分犢牛出現腹瀉癥狀，糞便逐漸變成粥狀，內含未消化的乳凝塊和血液，逐漸消瘦、虛弱、走路搖擺;至來校診斷時約有50%的犢牛發生腹瀉，病死率20%。剖檢變化主要在小腸，表現為小腸充盈、內有液狀內容物和灰白色的乳凝塊;腸黏膜變薄，有的嚴重出血，呈暗紅色;腸系膜淋巴結腫脹、出血。發病死亡犢牛的肺、肝、腎、脾、淋巴、小腸送檢，低溫保存，當日檢查。

1.2 試劑與儀器 麥康凱培養基、肉湯培養基、營養瓊脂、革蘭氏染色液均購自北京奧博星生物技術有限責任公司;生化反應檢測管、藥敏紙片均購自杭州天和微生物制劑有限公司。超凈臺購自蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;顯微鏡購自Olympus;電熱恒溫培養箱購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 實驗動物 6～8周齡SPF級BALB/c小鼠24只，由北京實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 細菌的分離鑒定 將病料無菌操作、釣菌劃線接種于麥康凱培養基、營養瓊脂平板和肉湯培養基，置于37℃恒溫箱中24h過夜培養。挑取單個典型疑似菌落進行革蘭氏染色、鏡檢。

2.2 細菌生化鑒定 將純化后的單個菌落接種于生化試驗管中37℃培養24h后，觀察并記錄結果。

2.3 動物致病性試驗 24只SPF小白鼠隨機分成2組，試驗組為20只，對照組為4只。試驗組的小鼠腹腔接種肉湯培養物，每只0.1mL，對照組用等量的滅菌普通肉湯進行腹腔注射。48h內觀察小鼠的精神狀態和記錄死亡情況。

2.4 藥敏試驗 將分離到的菌落均勻地涂抹到營養瓊脂培養基上，用滅菌鑷子貼上藥敏片后，置于37℃恒溫培養箱24h后測量抑菌圈直徑的大小。結果判定參照NCCLS（2009）的[4]。

3 結果與分析

3.1 細菌的分離鑒定 從病料中共分離出4株細菌，分別編號為S1～S4。S1～S3在麥康凱培養基上長出粉紅色、圓形凸起、表面濕潤、邊緣整齊的菌落，鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌;S4在營養瓊脂上長出整體黃綠色的菌落，鏡檢為兩端鈍圓、長短不一的革蘭陰性短桿菌。

3.2 細菌生化鑒定結果 生化試驗結果顯示，S1～S3分離菌符合大腸桿菌的生化特性（表1）。S4分離菌符合綠膿桿菌的生化特性（表2）。

3.3 動物致病性試驗 觀察接種肉湯培養物的小鼠，接種S1、S2、S3、S4以及S1～S4混合菌液肉湯培養物的小鼠，4只/組。接種S1肉湯培養物的4只小鼠在24h內均死亡;S2和S3接種小鼠24h內死亡2只，24～48h死亡2只;S4接種小鼠48h內4只全部死亡;S1～S4混合菌液24h內4只全部死亡。死亡小白鼠在接種12h后可見精神萎靡，腹瀉、被毛蓬松等癥狀。無菌條件下采取小鼠的肝臟進行細菌分離培養，鑒定結果與分離菌相同。

3.4 藥敏試驗結果 藥敏試驗結果（見表3），分離大腸桿菌對阿米卡星、頭孢吡肟、頭孢哌酮敏感，對諾氟沙星、慶大霉素、氨芐西林鈉、復方新諾明、新霉素、妥布霉素、環丙沙星耐藥;綠膿桿菌對阿米卡星、慶大霉素、諾氟沙星、頭孢吡肟、頭孢哌酮、妥布霉素敏感，對復方新諾明、新霉素、妥布霉素、環丙沙星耐藥。

4 討論

經細菌的分離鑒定，從送檢的3份病料中均分離出了大腸桿菌，從其中的1份病料的肺臟中分離出了綠膿桿菌。結合流行病學和臨床癥狀、小鼠的致病性試驗以及送檢前后的臨床治療用藥情況，判定引起該場犢牛腹瀉死亡的主要原因為大腸桿菌感染。盡管1例犢牛肺部分離到綠膿桿菌且其具有較強的致病作用（導致實驗感染小鼠死亡），但是實驗室藥敏試驗確定為敏感的藥物如慶大霉素、諾氟沙星以及氨芐西林等在臨床治療時均未能減少犢牛死亡，因此，綠膿桿菌可能只是部分犢牛在機體抵抗力下降的情況下繼發感染的因素。綠膿桿菌主要引起水貂的出血性肺炎、或是在畜禽繼發感染[5-6]。但由綠膿桿菌引起的犢牛腹瀉不容忽視，1985年彭德勛報道過由綠膿桿菌引起犢牛腹瀉的診斷和治療[7]。因此，綠膿桿菌是否是導致本次犢牛腹瀉的致病菌還需進一步研究。

腹瀉在犢牛中的發病率極高，導致犢牛腹瀉的原因有很多，主要的病原體有大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、輪狀病毒等[8]。在治療疾病的過程中，雖然抗生素起到了重要作用，但在長期使用過程中抗生素易產生耐藥性。在本次犢牛腹瀉的病例中，由于沒有及時進行實驗室診斷，盲目使用多種藥物，造成了犢牛大量死亡。根據實驗室診斷結果，采用阿米卡星配合頭孢哌酮有效控制住了本病，不再有新的病例發生。因此，臨床治療本病時，建議先進行藥敏試驗，篩選出敏感藥物后再進行治療。為防止犢牛發生脫水，應及時補充5%葡萄糖生理鹽水，并在其中添加碳酸氫鈉，避免腹瀉引起的酸中毒。為保護胃腸道黏膜，可口服鞣酸蛋白或次硝酸鉍。經過3～5d治療，即可有效控制犢牛死亡及新病例的出現。

大腸桿菌是一種條件性致病菌，只有在自身抵抗力弱時才會發病。這次犢牛嚴重腹瀉發生時，該地區出現降雪，加之壩上地區氣候寒冷，同時牛場環境相對較差，應激及飼養管理差是導致此次犢牛腹瀉的主要原因，因此，加強飼養管理是防治本病的重要措施。為了避免犢牛發生腹瀉，犢牛出生后應盡早吃食初乳，增強自身的抗病能力;避免犢牛受潮、受寒、飲用不潔的水;母牛妊娠期間給予豐富的蛋白質和維生素飼料，保持適當的運動;做好接產工作，母牛分娩前后徹底清洗消毒;在大腸桿菌常發的地區，可以根據血清型制備油乳劑滅活疫苗，從而進行犢牛的免疫預防。只有采取綜合的防控措施，才能避免犢牛腹瀉的發生，提高養殖效益。

參考文獻

[1]荔霞，王勝義，劉永明，等.犢牛腹瀉病因及其藥物防治研究進展[J].中國畜牧醫，2010，37（10）：161-165.

[2]尚婷婷. 犢牛大腸桿菌病病原的分離鑒定及其診治[D].楊凌：西北農林科技大學，2014.

[3]劉永彬.犢牛大腸桿菌病的病因和治療[J].今日畜牧獸醫，2017（05）：25.

[4]陳虹豆.2株致犢牛腹瀉大腸桿菌的分離鑒定和藥敏試驗[J/OL].畜牧與飼料科學，2019（02）：108-112

[5]朱利霞，王洪彬，楊楠，等.水貂綠膿桿菌病研究概述[J].黑龍江畜牧獸醫，2018（18）：214-217.

[6]翟晶晶，王珊，尹姣姣，等.兩株禽綠膿桿菌的分離鑒定與致病性研究[J].山西農業大學學報（自然科學版），2019，39（01）：107-112.

[7]彭德勛.犢牛綠膿桿菌腹瀉的診斷和防治報告[J].中國獸醫志，1989（08）：12-23.

[8]赫鳴睿.某牛場犢牛大腸桿菌病的實驗室診斷與藥敏試驗[J].現代畜牧獸醫，2019（01）：39-43.

（責編：張宏民）