長鏈非編碼RNA CDRT8通過調控YAP1表達對食管癌TE-1增殖的影響

食管癌是中國常見的惡性腫瘤之一[1]。雖然近年來食管癌的手術切除率較之前有所升高，并發癥下降，但是總體治療效果仍不盡如人意[2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼單鏈RNA，越來越多的研究表明，lncRNA在細胞的生理和病理過程中發揮重要的作用，與腫瘤的發生發展密切相關[3-4]。本研究擬通過檢測食管癌組織中lncRNA-CDRT8的表達水平，并采用質粒構建和轉染技術，觀察CDRT8對食管癌細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取利川市人民醫院心胸外科2016年4月至2018年1月手術切除的13例食管癌及癌旁組織，術前患者均未行任何輔助治療，術后均經病理證實為食管癌。本研究獲本院倫理委員會批準，患者對研究方案簽署知情同意書。標本取出后立即存放于液氮罐內保存。

1.2 材料

DMEM培養基和胎牛血清購自美國Hyclone公司。人食管癌細胞株TE-1購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。Trizol試劑盒和脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。PCR引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。實時熒光定量PCR(qPCR)相關試劑盒購自美國Promega公司。CDRT8-shRNA質粒(5′-UACCAUCUCACUCAGUCCCUG -3′)及陰性對照質粒購自廣州市銳博生物科技有限公司。細胞周期檢測試劑盒和噻唑藍(MTT)試劑盒購自碧云天生物技術研究所。一抗β-actin、Yes相關蛋白1(YAP1)、細胞周期蛋白E(Cyclin E)和細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)購自美國BD公司。

1.3 總RNA抽提及qPCR檢測

采用Trizol試劑一步法分別提取組織或細胞總RNA，反轉錄為cDNA，按照qPCR試劑盒說明書，以GAPDH為內參分別進行qPCR擴增，檢測CDRT8和YAP1基因表達水平。

1.4 細胞培養和質粒轉染

TE-1培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養。轉染前1天，將TE-1細胞接種于六孔板，要求轉染時細胞密度為60%，轉染CDRT8-shRNA重組質粒為實驗組，以轉染陰性對照質粒為對照組。轉染12 h后更換新鮮培養基。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期

收集轉染后48 h的兩組細胞，加入1 mL 70%乙醇固定，4 ℃下過夜，PBS溶液洗滌細胞，加入1 mL碘化丙啶染色液，4 ℃避光孵育30 min后用流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.6 MTT檢測

轉染48 h后，兩組細胞制備單細胞懸液，接種于96孔板。于接種后1、2、3、4、5 d分別進行MTT檢測，酶標儀檢測每孔在波長490 nm處的吸光度(OD)。

1.7 集落形成實驗

轉染48 h后，兩組細胞分別制備單細胞懸液，以1 000個/孔接種于6孔板。培養10 d后，甲醇固定20 min，0.1%結晶紫溶液染色30 min，統計集落形成數。

1.8 Western blot檢測

轉染48 h后收集兩組細胞，提取總蛋白，行SDS-PAGE電泳，電轉至 PVDF 膜，封閉液封閉后在4 ℃下一抗孵育過夜，二抗孵育，ECL化學顯影劑發光顯影。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 CDRT8在食管癌組織中的表達水平

qPCR檢測結果顯示，CDRT8在腫瘤組織和癌旁組織中的表達水平分別為3.26±0.3和1.10±0.14。CDRT8在食管癌組織中的表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

注：與癌旁組織相比，**P<0.01

2.2 CDRT8在兩組TE-1細胞中的相對表達水平

以轉染CDRT8-shRNA重組質粒為實驗組，以轉染陰性對照質粒為對照組。質粒轉染TE-1細胞后，實驗組中CDRT8相對表達水平顯著低于對照組(0.29±0.05比1.09±0.29)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 CDRT8對食管癌TE-1細胞周期的影響

實驗組TE-1細胞中細胞周期在G0/G1期的占比明顯升高，細胞周期在S期和G2/M期的占比明顯降低，提示低表達CDRT8可抑制TE-1細胞周期的進展。見表1。

表1 CDRT8對食管癌細胞TE-1細胞周期的影響(%，)

注：與對照組相比，aP<0.05，bP<0.01

2.4 CDRT8對TE-1細胞活力的影響

自第4 天開始，與對照組相比，CDRT8-shRNA質粒轉染的TE-1細胞的活力顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，提示CDRT8低表達能有效抑制TE-1細胞的活力，見圖2。

2.5 CDRT8對細胞增殖能力的影響

實驗組TE-1細胞的集落數目為(93.15±17.58)個，明顯低于對照組[(214.70±25.96)個]，且差異有統計學意義(P<0.01)，提示CDRT8低表達能有效抑制TE-1細胞的增殖能力。

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.6 qPCR檢測YAP1 mRNA表達水平

實驗組TE-1細胞中YAP1 mRNA的表達水平為0.18±0.03，較對照組(1.15±0.34)顯著下降，且差異有統計學意義(P<0.05)，提示CDRT8低表達可促進YAP1 mRNA的表達。

2.7 Western blot 結果

與對照組相比，實驗組TE-1細胞中YAP1、Cyclin E和CDK2蛋白表達水平顯著下降，提示CDRT8低表達可促進YAP1 mRNA的表達。見圖3。

圖3 兩組細胞中YAP1、Cyclin E和CDK2蛋白的表達情況

3 結論

繼微RNA(miRNA)之后，lncRNA極大豐富了機體中高度復雜的RNA調控網絡[5]。lncRNA是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，以往被誤判為基因組轉錄的“噪音”，其是由大于200個核苷酸構成的單鏈非編碼RNA，在人類基因組中巨大的數量和多方面的機制調控越來越引起人們的重視[6]。lncRNA已經成為多種疾病診斷、治療及預后評估的生物標志物[7]。近年來研究表明，PEG10、POU3F3、CCAT2、PVT1等眾多lncRNA參與食管癌的發生發展[8-11]。目前尚無CDRT8在人食管癌組織中的表達情況及其是否功能性參與食管癌的發生、發展的公開報道。

本研究采用qPCR技術對人食管癌組織進行檢測，結果均表明CDRT8在食管癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，CDRT8可能在食管癌中發揮致癌作用。利用shRNA質粒構建和轉染技術可在短期內大量降低細胞內CDRT8的表達水平。本研究干擾細胞內CDRT8的表達，在qPCR檢測結果證實細胞內CDRT8含量降低后，流式細胞術結果表明細胞周期停滯，MTT比色法和集落形成實驗結果均表明TE-1細胞的增殖和集落形成被顯著抑制，進一步證明CDRT8在人食管癌中發揮腫瘤促進因子的作用，參與調控食管癌的發生、發展。

YAP1是一種抑癌蛋白，在多種腫瘤中表現為高表達，參與腫瘤的發生、發展和惡性轉化[12]。有研究表明，YAP1 mRNA和蛋白在食管癌組織中明顯上調，且YAP1與食管癌的轉移和腫瘤分期密切相關[13-14]。本研究結果表明，抑制CDRT8表達后食管癌細胞中YAP1基因表達降低。YAP1可促進Cyclin E合成，Cyclin E結合并激活CDK2，Cyclin E-CDK2激酶復合物使細胞啟動DNA合成，不可逆轉地進入S期，增強細胞的增殖能力，促進腫瘤的發生發展[15-16]。抑制CDRT8表達后，食管癌細胞中Cyclin E和CDK2蛋白表達降低。CDRT8如何影響YAP1基因表達的分子機制尚未明確。lncRNA可作為分子海綿與miRNA結合進而抑制miRNA對下游相應靶基因mRNA的沉默效應。CDRT8可能通過與食管癌特異miRNA之間形成負反饋調節，進而影響YAP1基因的表達，發揮致癌作用。

綜上所述，CDRT8在食管癌組織中呈高表達，干擾CDRT8的表達能顯著抑制食管癌細胞的增殖，其可能的機制是下調YAP1基因的表達，為lncRNA成為食管癌治療的新靶點提供了理論依據。