上海地區人群丙型肝炎病毒1b型進化樹及其影響因素分析

丙型肝炎病毒(HCV)屬于黃病毒科黃病毒屬，為單正鏈RNA病毒[1]。HCV基因組全長9.6 kb，包含有5′ 非編碼區(5′UTR)、3′UTR及一個編碼約3 000個氨基酸的單一開放讀碼框(ORF)。HCV在宿主體內復制，每日能產生1 012個病毒[2]。由于HCV 非結構蛋白(NS)5B RdRp缺乏校錯功能，HCV每復制一代可產生104～105個堿基突變[3-4]。因此，HCV在宿主體內以“準種”形式存在。準種內的病毒，其保守區同源性在91%～99%，變異部分主要為高變區-1(HVR-1)、HVR-2。目前HCV基因型可分為HCV1～7型，基因型之間的序列差異約為30%。每個基因型又可分為不同的基因亞型，基因亞型間的序列差異為15%～20%[5]。研究顯示中國人群中HCV基因型主要為HCV 1b型(66%)，其次為2a型(14%)；但中國不同地區的HCV基因型分布存在差異，珠江三角洲地區HCV 6a型為第2大基因型[6]。目前中國HCV序列演變的規律及特征尚未明確，本研究通過擴增HCV 1b型NS3區序列，分析HCV 1b型序列變異情況、序列進化以及演變的規律，并進行人類白細胞抗原-A(HLA-A)及HLA-B類分子基因分型檢測，分析上海地區人群的HLA-Ⅰ類分子遺傳背景，明確上海地區人群的HLA-Ⅰ類分子對于HCV 1b型序列進化的影響。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選擇2010年7月至2015年4月期間上海交通大學附屬第一人民醫院消化科及感染科診治的89例慢性丙型肝炎患者，患者均為漢族，均對本研究知情同意。慢性丙型肝炎診斷標準參考2014年歐洲肝臟病協會(EASL)HCV感染診治指南[7]，選擇HCV抗體陽性，HCV RNA陽性(HCV RNA定量檢測結果在1.23 E+03～6.61 E+07 copies/mL)患者，排除近6個月內感染的患者。使用EDTA抗凝管采取全血標本。所有標本均排除人類免疫缺陷病毒(HIV)或乙型肝炎病毒(HBV)合并感染。

1.2 HCV RNA抽提及NS3區擴增

分離血清，抽提血清中HCV RNA(Qiagen病毒RNA抽提試劑盒)，采用型別特異性引物擴增法對HCV RNA進行基因分型。采用巢式PCR對HCV 1b基因型的HCV NS3區進行擴增，反應體系及循環參數按照 TaKaRaTaq 聚合酶說明書。取10 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外光下成像，觀察結果。將NS3區擴增陽性條帶產物送至上海英俊生物技術有限公司測序。

1.3 HCV序列分析

測序結果使用 CodonCode Aligner 軟件，參考序列峰圖進行拼接后得到核苷酸序列。使用Align軟件進行同源性分析。使用Ge-neious 7.0軟件進行核苷酸及氨基酸序列分析。使用TreeMaker和FigTree軟件，基因距離使用GTR方法，分析HCV NS3區的序列變異情況，并進行進化樹分析。

1.4 HLA-A和HLA-B類分子測定

分離血細胞，進行基因組DNA抽提，采用型別特異性引物PCR法檢測HCV 1b型患者相應的HLA-A及HLA-B類分子等位基因。分析人群HLA-A及HLA-B類分子基因頻率，并與數據庫中國人群HLA-A及HLA-B類分子基因頻率比較。

1.5 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。計量資料的比較采用獨立樣本t檢驗，組間HLA-A和HLA-B類分子頻率比較采用卡方檢驗，HLA-Ⅰ類分子陽性及陰性患者中序列突變頻率比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCV 1b型NS3區擴增

將PCR陽性結果送測序后，應用CodonCode Aligner軟件，根據測序峰圖進行序列拼接，最終得到89例HCV 1b型NS3區的全長核苷酸及氨基酸序列，序列經進化樹分析后最終證實為1b型。

2.2 上海地區人群的HLA-A及HLA-B類分子基因分布情況

表1 HLA-A分子基因頻率

表2 HLA-B分子基因頻率

2.3 中國不同地區人群中HLA-A和HLA-B類分子基因頻率比較

圖1中國不同地區人群中HLA-A和HLA-B類分子基因頻率比較AHLA-A類分子基因頻率BHLA-B類分子基因頻率

2.4 上海地區人群中HCV 1b型序列演變分析

將本研究擴增獲得的89例HCV 1b型NS3區進行進化樹分析，結果顯示89例序列主要落于兩個進化叢內，見圖2。

圖2 上海地區人群中HCV 1b型序列進化樹分析

2.5 HCV NS3區序列進化叢形成的影響因素

表3 不同進化叢中HLA-A及HLA-B類分子基因頻率比較

2.6 不同進化叢的一致序列比對結果

將進化叢1以及進化叢2序列分別進行序列比對，得到各自一致序列，再將不同進化叢一致序列與中國地區所有序列的一致序列以及HCV 1b型標準序列進行序列比對。結果顯示進化叢1與中國所有序列的一致序列高度一致，同源性達100%，進化叢1的一致序列與HCV 1b型標準序列之間的同源性為96.67%，進化叢2的一致序列與標準序列之間的同源性為96.2%。本研究結果顯示，HCV 1b型NS3區631個氨基酸中共有25個位點與標準序列不一致，其中14個位點位于已報道的T細胞表位內。

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