去甲萬古霉素血藥濃度檢測方法的建立及評價

董 迪，毛 璐，宋 菲，張 威，甄健存（北京積水潭醫院，北京 100035）

去甲萬古霉素是我國研制生產的糖肽類抗生素，其化學結構、藥理性質和抗菌作用與萬古霉素相似，但治療成本明顯低于萬古霉素。由于萬古霉素與去甲萬古霉素對耐藥金黃色葡萄糖球菌和表皮葡萄球菌感染有很好的療效，且不易誘導細菌產生耐藥性，因此深受臨床重視，實際應用中常需監測血藥濃度。測定萬古霉素血藥濃度的方法主要為高效液相色譜法和免疫法。采用高效液相色譜法檢測去甲萬古霉素血藥濃度靈敏度高、專一性好，但樣本處理方法復雜且測量速度慢，不符合醫院監測血藥濃度的實際情況，而目前市場上沒有專門針對去甲萬古霉素開發的檢測試劑盒。因此研究一種適用于醫療機構的去甲萬古霉素血藥濃度的方法十分必要。我院目前使用的血藥濃度檢測儀器為德國西門子公司的Viva-E 血藥濃度分析系統，檢測方法為酶放大免疫法（enzyme- multiplied immunoassay technique，EMIT），檢測原理是基于抗原（萬古霉素）與酶標抗原競爭抗體從而由酶活力反映抗原濃度。目前臨床常用的糖肽類抗菌藥物有萬古霉素、去甲萬古霉素、替考拉寧，均具有相似的結構，其中萬古霉素與去甲萬古霉素在結構上僅相差一個甲基，萬古霉素抗體可能會與抗原結構相似的去甲萬古霉素分子結合，從而利用相同原理檢測其濃度。

1 資料與方法

1.1 主要儀器

Viva-E 藥物濃度檢測儀（德國西門子公司）、10AT 高效液相分析系統（日本島津公司）、Inertsil ODS-SP 色譜柱（日本島津公司，4.6 mm×250 mm）、Academic 超純水儀（Millipore 公司）、TDZ5-W S 離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）、Research plus移液器（Eppendorf公司，100 ～ 1000 μL、20 ～ 200 μL）。

1.2 實驗試劑

去甲萬古霉素標準品（中國藥品生物制品檢定所，規格：150 mg，批號：130338-200303）、替考拉寧標準品（中國食品藥品檢定研究院，規格：100 mg，批號：130374-201002）、甲醇（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司，規格：500 mL，批號：20170303）、磷酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，規格：500 mL，批號：20170103）、三乙胺（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，規格：500 mL，批號：20140728）、磷酸二氫鉀（優級純，國藥集團化學試劑有限公司，規格：500 g，批號：20140627）、萬古霉素檢測試劑（酶放大免疫測定法，德國西門子公司，國械注進20162400276，批號：J5）、萬古霉素檢測定標液（德國西門子公司，國械注進20162400298，批號：J3）、治療藥物監測質控物（水平1，美國Bio-Rad公司，國械注進20122401399，批號：57341）、治療藥物監測質控物（水平2，美國Bio-Rad公司，國械注進20122401399，批號：57342）、實驗用水為Academic超純水儀制備。

1.3 實驗方法

本實驗應用EMIT法檢測萬古霉素血藥濃度，考察濃度為20 μg·mL-1去甲萬古霉素和替考拉寧是否能夠對檢測試劑進行有效響應，將具有有效響應的品種與高效液相檢測結果進行比較，并對日間差異、定量下限等項目進行初步研究。

2 結果與分析

2.1 萬古霉素檢測試劑對20 μg·mL-1去甲萬古霉素及20 μg·mL-1替考拉寧的響應情況

用空白血清分別配制去甲萬古霉素、替考拉寧待測樣本，每種藥品各制備3份樣本，濃度均為20 μg·mL-1。運用藥物濃度檢測儀萬古霉素濃度檢測模塊對樣品進行測量，3 份萬古霉素樣本檢測結果分別為：20.4、21.0、19.5 μg·mL-1；3 份替考拉寧樣本檢測結果分別為：1.4、0.8、1.6 μg·mL-1。由實驗結果初步推斷，對于萬古霉素檢測試劑，去甲萬古霉素具有較好的響應，替考拉寧響應微弱。

2.2 EMIT法與HPLC法檢測去甲萬古霉素血藥濃度的差異

參照Viva-E 藥物濃度檢測儀中萬古霉素標準曲線的建立流程，用空白血清分別配置去甲萬古霉素濃度為0、5、10、20、30、50 μg·mL-1的樣品作為定標液，由藥物濃度檢測儀自動模擬標準曲線，用空白血清配置去甲萬古霉素濃度為4、8、12、16、24、28、32、36、40、44、48 μg·mL-1的樣本并對其進行濃度檢測，每個濃度樣本平行制備3 個待測，平行檢測兩天（D1、D2）。為比較EMIT法與HPLC法的差別，我們參照EMIT法的標準曲線建立方法，用高效液相色譜法，對0、5、10、20、30、50 μg·mL-1的樣品作為定標液，用外標法對4、8、12、16、24、28、32、36、40、44、48 μg·mL-1的樣本進行濃度檢測，每個濃度樣本平行制備3 個待測。流動相為磷酸二氫鉀緩沖液∶甲醇（80∶20）等濃度洗脫，流速為1 mL·min-1，檢測波長為280 nm，檢驗結果見表1。EMIT法擬合曲線為二元三次方程，具體如下：Y = -10-8X3- 6×10-5X2+ 0.006 5 X + 0.272 9，R2= 0.999 4（D1）、Y = - 3×10-7X3- 3×10-5X2+ 0.006 X + 0.273 7，R2 = 0.999 8（D2）；HPLC法擬合曲線為二元一次方程：Y = 5 378.8 X + 953.03，R2 = 0.998 7。

將樣本用HPLC法及兩日EMIT法所測結果回收率進行配對t 檢驗，考察兩種方法是否具有差異，結果顯示P 值分別為0.467 8、0.342 0，均大于0.05，表明兩種方法所得結果回收率無統計學差異。

2.3 EMIT 法檢測去甲萬古霉素血藥濃度的日內及日間差異

12組不同濃度樣品，每組平行制備3個樣本待檢測，應用EMIT法、HPLC法分別檢測樣本，回收率均在85% ～ 115%之間，與標準值差異均小于15%，各組間CV均小于15%，具體結果見表2。

將EMIT 法兩日所測樣本結果回收率進行配對t檢驗考察日間差異，結果P 值為0.603 9，大于0.05，表明兩種方法日間差異無統計學意義。

2.4 EMIT法檢測去甲萬古霉素血藥濃度的定量下限

低濃度樣本組中，C、D、E、F組CV小于15%，僅F組各樣本回收率在85% ～ 115%，其他各組均出現過偏差大于±15%的情況，因此本研究初步建議檢測下限應≥3.0 μg·mL-1。

表1 去甲萬古霉素不同濃度樣本運用EMIT法與HPLC法的檢測結果. n = 3Tab 1 Results of norvancomycin plasma concentration in different samples detected by EMIT and HPLC. n = 3

表2 低濃度樣本EMIT法檢測情況Tab 2 Results of low concentration samples detected by EMIT

3 討論

3.1 可利用免疫法試劑盒的交叉反應檢測抗原結構類似物

已有研究表明，市售免疫法試劑盒與部分抗原結構類似物存在交叉反應，如使用地高辛試劑盒檢測杠柳毒苷[1]，使用慶大霉素試劑盒檢測依替米星[2]。酶放大免疫法原理是樣品中萬古霉素和帶有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的萬古霉素（試劑1）競爭結合抗體（試劑2），通過檢測酶活性下降程度來反映樣品中的萬古霉素濃度。根據我國藥典中《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》，配體結合分析方法應進行特異性實驗，以考察結構相關物質或預期合用藥物對方法的干擾。從另一個角度看，我們也可以利用其特異性方面的缺陷，來考察該方法是否可用于結構相關物質的濃度檢測。

3.2 EMIT法適用于醫療機構檢測患者去甲萬古霉素血藥濃度

由于萬古霉素和去甲萬古霉素機制用途相同，以原型經腎臟排泄在體內幾乎不代謝，因此臨床一般情況下在同一待測樣本中不會彼此干擾。本研究結果顯示，使用我院Viva-E 藥物濃度檢測儀進行檢測去甲萬古霉素線性較好，日間差異處于《中國藥典》要求范圍內，同時考慮到免疫法快速、靈敏、自動化程度高等優勢，EMIT 法適用于醫療機構檢測患者去甲萬古霉素血藥濃度。隨著檢測技術的發展，除了HPLC[3]、UPLC[4]等常用液相色譜技術，LC-MS/MS[5]、UPLC-MS/MS[6]等檢測去甲萬古霉素血藥濃度的液質聯用方法相繼開發，各醫療機構可以根據實際情況選用合適的檢測方法。

3.3 不同檢測方法間去甲萬古霉素血藥濃度的差異探討

本實驗結果未顯示HPLC法與EMIT法檢驗去甲萬古霉素血藥濃度存在顯著性差異，在PubMed、中國期刊全文數據庫、中國科技期刊數據庫、數字化期刊全文數據庫中檢索到相關文獻1篇，其結果表明兩種方法的測定結果差異無統計學意義[7]，與本研究結果一致。在上述數據庫中檢索類似血藥濃度檢測方法學比較的文獻，發現有研究顯示檢測萬古霉素血藥濃度時，HPLC法與熒光偏振免疫法（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）可能存在顯著性差異[8-9]。FPIA 與EMIT 均為目前常用的基于免疫學原理的藥物濃度檢測方法，根據本實驗結果數據顯示，在≥20 μg·mL-1的實驗組中，也存在著EMIT 法測得值較HPLC法測得值偏高的問題，選取≥20 μg·mL-1區間數據進行配對t 檢驗比較時發現，EMIT、HPLC 測得值在上述區間存在顯著性差異（EMIT法D1、D2與HPLC法標準偏差P值分別為0.000 012 3、0.000 365 4，均小于0.05），其原因可能為代謝降解產物的干擾所致[10]。因此，EMIT 法與HPLC 法是否存在差異可能受數據采集區間及樣本數量影響，還需要更多真實世界的數據加以驗證。

3.4 需要更多去甲萬古霉素循證研究指導臨床用藥

目前利用去甲萬古霉素血藥濃度監測數據缺乏權威的藥代/藥效動力學數據及專業指南支持。而萬古霉素有更多的臨床、實驗、循證證據，近年來推出了多部指南，對臨床合理用藥提供了有效幫助。去甲萬古霉素與萬古霉素抗菌譜相似，治療效果相當，而去甲萬古霉素在抗感染應用中的治療成本明顯低于萬古霉素[11]。去甲萬古霉素為我國主要研發生產的抗菌藥物，具有很好的市場前景和臨床需求，且在醫保控費日趨嚴峻的現實情況下，優勢明顯。因此，臨床需要科研及臨床工作者提供更多的數據，應用血藥濃度監測技術，指導臨床用藥，保障患者用藥安全。