CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)腎病患者他克莫司臨床應(yīng)用指導(dǎo)分析

李曉琳，劉 冰（.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心，天津 3006；.河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 05005）

腎病是常見(jiàn)疾病的一種，發(fā)病多與免疫功能異常、炎癥反應(yīng)等有關(guān)，可導(dǎo)致患者腎功能嚴(yán)重下降，甚至引發(fā)腎衰竭[1]。目前臨床上通常會(huì)通過(guò)免疫抑制劑對(duì)腎病患者進(jìn)行治療，他克莫司是常見(jiàn)的一種免疫抑制劑，此藥物療效有較大的個(gè)體化差異，患者對(duì)藥物反應(yīng)也完全不同，以常規(guī)的藥物濃度監(jiān)測(cè)來(lái)對(duì)藥物劑量進(jìn)行調(diào)整存在一定的局限性，難以有效預(yù)防藥品不良反應(yīng)的發(fā)生[2]。近年來(lái)，臨床上發(fā)現(xiàn)CYP3A5酶屬于他克莫司代謝的關(guān)鍵酶，基于此，臨床上多通過(guò)檢測(cè)CYP3A5基因多態(tài)性來(lái)對(duì)他克莫司的血藥濃度、不良反應(yīng)等進(jìn)行分析[3]。本研究對(duì)接受他克莫司治療的90 例腎病患者開展CYP3A5*3 多態(tài)性測(cè)定，探討CYP3A 5*3 多態(tài)性對(duì)他克莫司濃度、不良反應(yīng)的影響。

1 資料與方法

1.1 研究資料

1.1.1 病例資料 此次共納入病例90 例，均為2016年6 月- 2017 年6 月在本院接受治療的腎病患者，均為漢族。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合難治性腎病綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）耐受他克莫司治療；（3）均很好的完成相應(yīng)的治療；（4）已配合簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他器官、系統(tǒng)疾病；（2）應(yīng)用他克莫司治療前1個(gè)月使用過(guò)其他免疫抑制劑、細(xì)胞毒性藥物；（3）存在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素使用禁忌癥。患者性別：男性49例（54.44%），女性41例（45.56%）；年齡：26 ～ 67歲，平均（46.53±7.65）歲。此次研究已通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)審批。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 （1）主要試劑：PuregeneDNA 提取試劑盒（德國(guó)Qingen 公司）；無(wú)水乙醇（上海振興化工廠）；PCR 試劑盒（德國(guó)Qingen 公司）；引物合成購(gòu)自上海英俊生物技術(shù)公司；DNA Marker、瓊脂糖、5×TAE緩沖液（北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）；溴化乙淀（德國(guó)Boehringer Mannhein 公司）。（2）主要儀器：常溫離心機(jī)（上海醫(yī)用儀器廠）；紫外分光光度儀、Master cycler PCR 儀（Eppendorf 公司）；電泳儀（DYCP-31，北京六一儀器廠）；血藥濃度監(jiān)測(cè)儀（美國(guó)Abbott公司）。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 90 例患者均給予他克莫司（福建科瑞藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20160211）治療，劑量3 ～ 4 mg·kg-1·d-1，口服，bid。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）他克莫司血藥濃度檢測(cè)：給藥12 h后，采集患者晨起空腹靜脈血液標(biāo)本，2 ～ 3 mL，常規(guī)抗凝處理，取200 μL血液標(biāo)本與200 μL樣本萃取液，置入離心管，搖晃5 ～ 10 s使其均勻，離心處理38 500 r·min-1，共5 min，取上清，置入化學(xué)發(fā)光免疫系統(tǒng)，測(cè)定血藥濃度。

（2）CYP3A5基因多態(tài)性測(cè)定：①外周血DNA提取：采集患者晨起空腹靜脈血液標(biāo)本3 mL，對(duì)外周血基因組DNA進(jìn)行提取：在1.5 mL EP管中加入20 μL蛋白酶K，并加入200 μL全血標(biāo)本與200 μL裂解液，行15 s漩渦混勻處理，置入56 ℃水浴箱，進(jìn)行10 min孵育，瞬時(shí)離心。將200 μL乙醇加入，行15 s 漩渦混勻處理，瞬時(shí)離心，將以上內(nèi)容轉(zhuǎn)移至2 mL收集管中，離心處理8000 r·min-1，1 min，去除濾液。在新收集管內(nèi)加入500 μL 裂解液，離心處理14 000 r·min-1，3 min，去除濾液，轉(zhuǎn)移至另一收集管，離心14 000 r·min-1，1 min。在1.5 mL離心管中置入收集管圓柱，去除濾液，加入200 μL蒸餾水，置于室溫下5 min，離心處理8000 r·min-1，1 min，去除濾液即可得到DNA。通過(guò)紫外分光光度法對(duì)DNA濃度進(jìn)行測(cè)定。②DNA的OD 值測(cè)定：取DNA 提取液5 μL，加入195 μL 純水進(jìn)行稀釋處理，通過(guò)紫外分光光度計(jì)對(duì)OD值進(jìn)行測(cè)定。③CYP3A5基因多態(tài)性檢測(cè)：通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-序列特異性引物分析技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行擴(kuò)增，在PCR管中置入25 μL工作液、3 μL DNA，混勻。在引物板每孔中加入10 μL以上混合液，將15 ～ 20 μL石蠟油加入，封板。循環(huán)參數(shù)：96 ℃ 2 min，96 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，共循環(huán)5次；96 ℃ 20 s，65 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共進(jìn)行10個(gè)循環(huán)；96 ℃ 20 s，63 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共循環(huán)15次；72 ℃ 2 min。對(duì)循環(huán)末的熒光信號(hào)進(jìn)行收集，并展開溶解曲線分析。

1.3 結(jié)果判定

對(duì)每個(gè)孔的Ct 值、特征性熔解曲線導(dǎo)數(shù)峰進(jìn)行記錄，Ct 值在10 以上，22 及以下，或D（1）/D（2）在1.5及以下為陽(yáng)性；Ct在22以上，或者D（1）/D（2）在1.5以上為陰性。1孔陽(yáng)性，2孔陰性為*1/*1型；1孔、2孔均為陽(yáng)性為*1/*3型；1孔陰性，2孔陽(yáng)性為*3/*3型。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）90 例患者CYP3A5 基因類型。（2）不同基因型患者用藥后1 個(gè)月、6 個(gè)月、12 個(gè)月時(shí)的血藥濃度、日劑量、血藥濃度與日劑量比值（血藥濃度/日劑量）。（3）不同基因型患者不良反應(yīng)發(fā)生情況，主要包括肝損傷、高血糖、血液毒性、高血壓、胃腸道反應(yīng)等他克莫司引發(fā)的不良反應(yīng)。（4）CYP3A5基因多態(tài)性與他克莫司不良反應(yīng)的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 患者基因類型

90例患者中，21例為*1/*1型（23.33%），29例為*1/*3型（32.22%），40例為*3/*3型（44.44%）。

2.2 不同基因型患者血藥濃度

用藥后1 個(gè)月、6 個(gè)月、12 個(gè)月，*1/*1 型、*1/*3型患者血藥濃度、血藥濃度/日劑量均較*3/*3型患者低，且*1/*1型、*1/*3型日劑量較*3/*3型患者高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），見(jiàn)表1。

2.3 不同基因類型患者不良反應(yīng)發(fā)生情況

*1/*1 型、*1/*3 型患者不良反應(yīng)發(fā)生率較*3/*3型患者低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），見(jiàn)表2。

2.4 CYP3A5基因多態(tài)性與他克莫司不良反應(yīng)的相關(guān)性

90 例患者，共27 例發(fā)生不良反應(yīng)，對(duì)其不良反應(yīng)可能的影響因素展開單因素分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)生不良反應(yīng)者與未發(fā)生者在性別、年齡、尿蛋白定量、血清肌酐方面，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05），發(fā)生不良反應(yīng)者血藥濃度較未發(fā)生者高，發(fā)生不良反應(yīng)患者的*3/*3型基因所占比例較未發(fā)生者高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），見(jiàn)表3。

依據(jù)表3，以平均血藥濃度、*1/*1 型、*1/*3 型、*3/*3 型基因?yàn)樽兞空归_Logistic 回歸分析，發(fā)現(xiàn)*3/*3型CYP3A5 基因是導(dǎo)致不良反應(yīng)發(fā)生的主要影響因素，見(jiàn)表4。

3 討論

他克莫司是腎小球疾病治療的主要藥物，此藥物能夠與細(xì)胞受體進(jìn)行結(jié)合，促使靶細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化、鈣離子通道信息傳遞改變，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制作用，達(dá)到改善疾病的效果[4]。他克莫司進(jìn)入血液后，主要通過(guò)細(xì)胞色素P450酶系的CYP3A亞家族進(jìn)行代謝，不同個(gè)體對(duì)他克莫司的生物利用度存在較大差異性，因此腎小球疾病患者通過(guò)他克莫司治療的效果、安全性存在個(gè)體性[5]。以往臨床上多通過(guò)血藥濃度測(cè)定來(lái)確定他克莫司劑量，但此方法有一定局限性，無(wú)法實(shí)現(xiàn)他克莫司劑量的精準(zhǔn)控制。因此，近年來(lái)臨床上多對(duì)CYP3A5 基因多態(tài)性進(jìn)行分析，個(gè)體化用藥，以對(duì)他克莫司劑量進(jìn)行精準(zhǔn)化控制，在達(dá)到預(yù)期效果的同時(shí)，減少不良反應(yīng)的發(fā)生。CYP3A5主要表達(dá)于肝臟、腎臟、小腸中，其中肝內(nèi)占30%左右，腸內(nèi)占70%以上，參與藥物代謝的CYP3A 占60%以上。人體內(nèi)的CYP3A 亞型主要有CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7等，其中參與他克莫司代謝中的主要為CYP3A4、CYP3A5，CYP3A3水平高低直接影響他克莫司生物利用度[6]。

近年來(lái)，關(guān)于基因多態(tài)性的研究不斷深入，臨床上越來(lái)越重視個(gè)體基因水平與藥物代謝之間的關(guān)聯(lián)性。大量臨床研究表明CYP3A5基因多態(tài)性直接影響他克莫司的血藥濃度，對(duì)腎小球疾病患者采用他克莫司進(jìn)行治療時(shí)，臨床上逐漸重視CYP3A5基因多態(tài)性檢測(cè)[7-8]。齊林等[9]關(guān)于CYP3A5 基因多態(tài)性與他克莫司血藥濃度相關(guān)性的研究以腎移植患者為對(duì)象，結(jié)果顯示*3/*3 型基因患者血藥濃度、術(shù)后不良反應(yīng)發(fā)生率最高。本次研究以腎小球疾病患者為研究對(duì)象，探討不同CYP3A5基因類型患者他克莫司血藥濃度與不良反應(yīng)發(fā)生情況，結(jié)果顯示，用藥后1 個(gè)月、6 個(gè)月、12個(gè)月，*1/*1型、*1/*3型患者血藥濃度、血藥濃度/日劑量均較*3/*3型患者低，且*1/*1型、*1/*3型日劑量均較*3/*3型患者高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。結(jié)果提示，若腎小球疾病患者口服相同劑量的他克莫司，*1/*1型、*1/*3型患者血藥濃度低于*3/*3型患者，為達(dá)到預(yù)期療效，1/*1型、*1/*3型患者需服用更多的劑量，才可達(dá)到與*3/*3型患者相同的血藥濃度。

表1 不同基因型患者血藥濃度對(duì)比Tab 1 Comparison of blood concentration of patients with different genotypes

表2 不同基因類型患者不良反應(yīng)發(fā)生情況對(duì)比.例（%）Tab 2 Comparison of adverse reactions in patients with different gene types. case(%)

表3 90例患者不良反應(yīng)影響因素的單因素分析Tab 3 Univariate analysis of factors influencing adverse reactions in 90 patients

表4 Logistic回歸分析結(jié)果Tab 4 Results of logistic regression analysis

此外，本次研究結(jié)果還顯示，在不良反應(yīng)發(fā)生率方面，*1/*1型患者是19.05%，*1/*3型是24.14%，均較*3/*3 型的40.00%低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。CYP3A5 基因位于人類第7 號(hào)染色體，共包含外顯子13 個(gè)，長(zhǎng)31.8 kb，屬于高度變異基因之一，突變點(diǎn)位較多，包括CYP3A5*2、CYP3A 5*3、CYP3A5*4 等，其中在各種族人群中發(fā)生頻率最高的是CYP3A5*3[10]。CYP3A5*3突變可導(dǎo)致CYP3A5 mRNA 出現(xiàn)可變性的剪切，生存不穩(wěn)定截?cái)嗟鞍踪|(zhì)，因此攜帶CYP3A5*3/*3 基因的人體無(wú)法對(duì)存在酶活性的CYP3A5 蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)，此類人群便屬于他克莫司慢代謝型。采用他克莫司治療腎小球疾病時(shí)，CYP3A5*1/*1型基因患者有明顯的清除優(yōu)勢(shì)存在，可導(dǎo)致他克莫司代謝增加，使藥物暴露降低，因此藥品不良反應(yīng)較少。而CYP3A5*3/*3 型基因患者無(wú)法對(duì)他克莫司進(jìn)行充分性代謝，雖然僅需要低劑量的他克莫司即可達(dá)到血藥濃度，但不良反應(yīng)發(fā)生率較高。本次研究采用Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)*3/*3型CYP3A5基因是導(dǎo)致腎小球疾病患者接受他克莫司治療時(shí)發(fā)生不良反應(yīng)的主要影響因素。因此，建議臨床在采用他克莫司對(duì)腎小球疾病患者進(jìn)行治療時(shí)，可對(duì)患者CYP3A5基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)他克莫司劑量進(jìn)行確定，以達(dá)到提升療效、降低不良反應(yīng)發(fā)生率的效果。

綜上所述，CYP3A5基因多態(tài)性直接影響腎小球疾病患者他克莫司血藥濃度與不良反應(yīng)，*3/*3 型患者血藥濃度、不良反應(yīng)發(fā)生率均高于*1/*1 型、*1/*3型患者。由于此次研究樣本量較小，僅開展回顧性研究，尚需增加樣本量展開大量研究，以進(jìn)一步探討CYP3A5基因多態(tài)性與腎小球疾病患者他克莫司血藥濃度、不良反應(yīng)的相關(guān)性。