云南西盟蔗區發現檢疫性病害甘蔗白葉病

張榮躍　李文鳳　黃應昆　王曉燕　單紅麗　李婕　倉曉燕　羅志明　尹炯

摘要：研究旨在明確2018年在云南西盟蔗區發現的甘蔗病害是否為植原體引起的甘蔗白葉病。使用植原體16S rRNA基因序列通用引物Pl/P7和R16F2n/R16R2對10份采自云南西盟蔗區的疑似甘蔗白葉病樣品進行巢氏PCR檢測，并將巢氏PCR產物進行克隆測序和序列分析。巢氏PCR結果表明：所有10份樣品均能擴增得到1240 bp左右的片段。測序結果表明所有獲得的10條16S rRNA基因序列大小均為1247 bp，序列間的核苷酸一致性為100%。BLASTN分析表明，從病株擴增到的所有核苷酸序列與先前云南臨滄甘蔗白葉病植原體分離物LC7和LC9的16S rRNA基因序列（Genbank登陸號：KR020691和KR020692）的核苷酸序列一致性為100%。虛擬RFLP分析表明，西盟分離物的16S rRNA基因序列的酶切圖譜與16SrXI-B亞組植原體相同。本研究結果表明，云南西盟蔗區發現的甘蔗病害為16SrXI-B亞組植原體引起的甘蔗白葉病。

關鍵詞：云南;西盟;檢疫性病害;植原體;甘蔗白葉病;16SrXI-B亞組

中圖分類號：S435.661

文獻標志碼：A

論文編號：cjas18120017

0引言

甘蔗白葉病（Sugarcane White Leaf， SCWL）是由植原體引起的甘蔗毀滅性病害，該病于1954年首次在泰國發現[1]，現己廣泛發生于越南、緬甸、菲律賓、巴基斯坦、印度、斯里蘭卡等植蔗國家，給當地甘蔗和制糖產業造成了巨大的經濟損失[2-8]。中國臺灣于1962年報道了該病的發生[9]，2013年Li等[10]首次在云南保山蔗區采集的甘蔗樣品上檢測發現SCWL植原體。SCWL主要癥狀表現為葉片白化、分蘗增多和矮化[11]。SCWL植原體主要通過帶病蔗種進行遠距離傳播，且傳播性極強，此外，在田間SCWL植原體還可通過葉蟬自然傳播[4，12-13]。先前的病原多樣性研究表明16SrXI-B亞組和16SrXI-D亞組植原體均可引起SCWL[14-15]。

目前，SCWL只在云南保山蔗區和臨滄蔗區發現[5-17]。2018年6月，筆者在對云南西盟蔗區甘蔗病蟲害進行調查時，發現疑似SCWL癥狀的植株。為明確病原，筆者采集了10份疑似SCWL病樣，采用植原體16S rRNA基因序列通用引物對Pl/P7和R16F2n/R16R2對疑似病株進行了檢測鑒定。以期為科學有效防控SCWL提供理論依據和技術支撐。

1材料與方法

1.1疑似SCWL樣品

2018年6月從云南西盟蔗區采集的10份疑似SCWL樣品，品種均為‘粵糖93-159。

1.2植物總DNA的提取

每個樣品取病葉0.2 g，采用北京全式金生物技術公司的Easy Pure plant Genomic DNA Kit植物DNA提取試劑盒提取葉片總DNA，具體方法步驟按照說明書進行。

1.3巢式PCR檢測

使用植原體16S rRNA基因序列通用引物對Pl/P7[18]和Rl6F2n/Rl6R2[14]進行巢氏PCR擴增。以Pl/P7為引物進行第一次PCR擴增，25 uL反應體系為含有lOxPCR Buffer 2.5 uL、引物Pl/P7（20 umol/L）各l uL、MgCl2 （25 mmol/L）2 uL、dNTPs （10 mmol/L） 2.0 uL、Taq酶（5 U/uL） 0.2 uL、ddH20 15.3 uL、DNA模板1.0 uL。PCR反應條件為：940C預變性3 min; 94℃變性30 s，55CC退火30 s，72℃延伸l min，35個循環;最后72℃延伸10 min。取l uL第一次PCR擴增產物（稀釋30倍）作為模板，R16F2n/R16R2為引物進行第二次PCR擴增，反應體系與第一次PCR相同，擴增程序為：940C預變性3 min; 94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸l min，35個循環;最后72C延伸10 min。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 PCR產物克隆、測序及序列分析

利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）回收目的片段，并將其與pEASY-T5（北京全式金生物技術有限公司）進行連接轉化，每個轉化挑選6個陽性克隆送華大基因測序。測序結果使用BLASTN進行對比。使用DNAMAN v6.0進行序列一致性分析。

1.5 16S rRNA基因序列的虛擬RFLP分析

使用在線植原體分類工具iPhyClassifier（http：//plantpathology. Ba. Ars. usda. gov/cgibin/ resource/iphyclassifier.cgi）對西盟SCWL植原體的16S rRNA基因序列進行虛擬RFLP分析和相似性系數分析[19]。

2結果與分析

2.1巢式PCR檢測及序列分析

使用植原體16S rRNA基因序列通用引物對Pl/P7和R16F2n/R16R2的巢氏PCR擴增結果表明10份疑似SCWL樣品和陽性對照均檢測到約1.2 kb左右的條帶，與預期目標片段大小一致（圖1）。將目標片段回收、克隆和測序，測序結果表明，所有樣品擴增出的特異性片段大小均為1247 bp，序列間的核苷酸一致性為100%。BLASTN分析結果表明，所有10條序列（Genbank登陸號：MK028610-MK028619）與先前云南臨滄SCWL植原體分離物LC7和LC9的16S rRNA基因序列（Genbank登陸號：KR020691和KR020692）的核苷酸序列一致性為100%。

2.2 16S rRNA基因序列的虛擬RFLP分析

利用植原體分類鑒定在線工具iPhyClassifier對本研究獲得的16S rRNA基因序列進行虛擬RFLP分析，結果表明，本研究獲得的16S rRNA基因序列的虛擬RFLP酶切圖譜與16SrXI-B亞組植原體的虛擬RFLP酶切圖譜相同（圖2），圖譜的相似系數為1.00。

3結論與討論

本研究對云南西盟蔗區采集的10份疑似SCWL甘蔗樣品進行巢式PCR檢測及測序分析，BLASTN結果表明本研究擴增獲得的序列為SCWL植原體16SrRNA基因序列，虛擬RFLP分析表明本研究獲得的SCWL植原體分離物為16SrXI-B亞組植原體，因此，本次云南西盟蔗區發現的甘蔗病害可以確診為16SrXI-B亞組植原體引起的SCWL。西盟蔗區也成為繼云南保山蔗區和臨滄蔗區外又一個發現SCWL的蔗區。本研究結果可為云南今后開展SCWL的深入研究和科學有效防控奠定基礎和提供參考依據。

SCWL是一種及其危險的甘蔗病害，可對甘蔗造成毀滅性災害。Li等[20]2013年在云南保山蔗區首次發現SCWL后，SCWL在云南蔗區擴展蔓延十分迅速，給云南蔗糖產業發展帶來了嚴重災害威脅。如得不到有效防控，可能還會給廣西、廣東等蔗區帶來潛在的威脅。因此，對于SCWL必須給予高度的重視，并采取有效防控措施阻止其擴展蔓延，確保云南甘蔗安全生產和蔗糖產業可持續發展。由于SCWL主要通過帶病蔗種進行遠距離傳播，建議加強對甘蔗良繁基地擴繁種苗和引進及外調甘蔗品種的SCWL的檢疫和監測，嚴禁從發生SCWL的蔗區和田塊引種和留種，同時，要加強對SCWL發病區域的檢查，及時清除銷毀病株，從源頭上控制其擴散蔓延。另外，下一步需要深入研究SCWL的傳播媒介及其傳毒機理，探明甘蔗品種對SCWL的抗性，為SCWL的有效防控提供理論指導和科學依據。

參考文獻

[1]

Marcone C. Phytoplasma diseases of sugarcane[J].Sugar Tech，2002，4（3/4）：79-85

[2]

Kumarasinghe N C，Jones P. Identification of white leaf disease ofsugarcane in Sri Lanka[J].Sugar Tech，2001，3（1）：55-58

[3] Rao G P，Singh A，Singh H B，et al Phytoplasma diseases ofsugarcane： characterization， diagnosis and management[J].lndianJournal of Plant Pathology，2005，23（1/2）：1-21

[4] Hanboonsong Y'Ritthison W，Choosai C，et al.Transmission ofsugarcane white leaf phytoplasma by Yamatotettix flavovmatus，anew leafhopper vector[J].Journal of Economic Entomology，2006，99（5）：1531-1537.

[5] Them M M， Jamjanya T， Kobori Y， et al. Dispersal of theleafhoppers Matsumuratettix hiroglyphicus and Yamatotetlixflavovittatus （Homoptera： Cicadellidae）， vectors of sugarcane whiteleaf disease[J].Applied Entomology and 200logy，2012，47（3）：255-262.

[6] Wongkaew P. Sugarcane white leaf disease characterization，diagnosis development， and control strategies[J].Functional PlantScience Biotechnology，2012，6（2）：73-84.

[7] Win N K K， Jung H Y. The distribution of phytoplasmas inMyanmar[J].Journal of Phytopathology，2012，160（3）：139-145.

[8]

Wang X Y， Li W F， Huang Y K， et al. Identification of sugarcanewhite leaf phytoplasma in fields and quaratine sugarcane samples inYunnan province， China[J].Sugar Tech，2015，17（1）：85-88.

[9]

Ling K C. White leaf disease of sugarcane[J].Taiwan Sugar，1962，

[10] 11 W F， Wang X Y， Huang Y K， et al. First report of sugarcanewhite leaf phytoplasma in Yunnan province， China[J].CanadianJournal of Plant Pathology，2013，35（3）：407-410.

[11] Wongkaew P， Hanboonsong Y， Sirithorn P， et al. Differentiation ofphytoplasmas associated with sugarcane and gramineous weedwhite leaf disease and sugarcane grassy shoot disease by RFLP andsequencing[J].Theoretical Applied Genetics，1997，95（4）：660-663.

[12] Hanboonsong Y， Choosai C， Panyim S， et al. Transovarialtransmission of sugarcane white leaf phytoplasma in the insectvector Matsumuratettix hiroglyphicus （Matsumura） [J].lnsectMolecular Biology，2002，11（1）：97-103.

[13] Rattanabunta C，Hanboonsong Y Sugarcane white leaf diseaseincidences and population dynamic of leafhopper insect vectors insugarcane plantations in northeast Thailand[J].Pakistan Journal ofBiological Sciences，2015，18（4）：185-190.

[14]

Lee I， Gundersenrindal D E，Davis R E，et al. Revised classificationscheme of phytoplasmas based on RFLP analyses of 16S rRNA andribosomal protein gene sequences[J].International Journal ofSystematic Bacteriology，1998，48（4）：11 53-11 69.

[15] Zhang R Y'L1 W F，Huang Y K， et al. Group 16SrXI phytoplasmastrains， including subgroup 16SrXI-B and a new subgroup， 16SrXI-D， are associated with sugarcane white leaf[J].lnternational Journalof Systematic and Evolutionary Microbiology，2016，66（1）：487-491

[16] Wang X Y-Li W F'Huang Y K， et al. Analyses of the 16S-23Sintergenic region of the phytoplasma causing the sugarcane whiteleaf disease in Yunnan province， China[J].Tropical Plant Pathology，2014，39（2）：184-188

[17]李文鳳，工曉燕，黃應昆，等.云南蔗區發現由植原體引起的檢疫性病害甘蔗白葉病[J]植物病理學報，2014，44（5）：556-560.

[18] Deng S，Hiruki C.Amplication of 16S rRNA genes fromculturable

and

nonculturable

Mollicutes[J].Journal

ofMicrobiological Methods，1991，14（1）：53 -61.

[19] Yan Z，Wei W， Ing-Ming L，et al. Construction of an interactiveonline phytoplasma classification tool， iPhyClassifier， and itsapplication in analysis of the peach X-disease phytoplasma group（16Srlll） [J].lnternational Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology，2009，59（10）：25 82-2593

[20]李文鳳，單紅麗，黃應昆，等.檢疫性病害甘蔗白葉病的發生危害與防控對策[J]中國糖料，2014（3）：66-68