Bcl-2/Beclin1復合物對細胞凋亡與自噬的調節作用*

張 怡，高維娟

（河北中醫學院/河北省中醫藥防治心腦血管病基礎研究重點實驗室，河北石家莊 050091）

細胞凋亡（apoptosis）和細胞自噬（autophagy）是細胞自我銷毀的兩種主要機制。凋亡，又稱為I型程序性細胞死亡，表現為細胞皺縮、染色質濃縮、DNA降解和片段化，細胞分裂成凋亡小體，隨后被吞噬細胞吞噬、降解[1]。自噬，又稱為II型程序性死亡，是一個高度保守的細胞內進化過程。具有雙層膜結構的自噬體包裹長壽蛋白和受損細胞器，并與溶酶體融合，通過溶酶體途徑移除，在溶解長壽蛋白和受損細胞器的過程中釋放能量，從而為細胞供能[2-3]。大量研究發現，細胞凋亡和細胞自噬之間存在著錯綜復雜的關系。多種刺激因素，如電離輻射、內質網應激、缺氧缺血、化療藥物等均可導致凋亡和自噬的發生，但由于刺激的程度和刺激時間的不同，凋亡和自噬的強弱也有所差別。如在腦缺血早期階段，細胞自噬被迅速激活，并抑制細胞凋亡的發生，凋亡和自噬以相互排斥的形式發展；但隨著缺血時間的延長，自噬被過度激活，導致細胞受損，進而引發細胞凋亡的發生，并最終通過凋亡依賴途徑誘導細胞死亡[4]。細胞凋亡和自噬之間可能存在著某種“切換開關”，確定二者的“切換開關”對于某些疾病，如腫瘤、腦缺血、神經退行性病變的治療及藥物研發等具有重要意義。Bcl-2是重要的凋亡調控蛋白，具有抗凋亡的作用，大量研究證實，Bcl-2還可通過結合Beclin1對細胞自噬起到調控作用[5]。Beclin1是細胞自噬的關鍵調控因子，主要參與自噬體的形成[6]。研究證實，Beclin1與細胞凋亡亦有密切關系，可通過調節Bcl-2的功能調控細胞凋亡。因此，Bcl-2/Beclin1復合物被認為是細胞凋亡和自噬的“活性開關”。根據近年來國內外相關報道，本文對Bcl-2/Beclin1復合物在細胞凋亡和自噬中的調控作用進行綜述。

1 Bcl-2

Bcl-2（B-cell lymphoma 2）家族對細胞凋亡具有重要的調控作用。根據Bcl-2家族的結構和作用，可以將其分為3大類：①含4個結構域BH1-4，并含有1個疏水的BH3（Bcl-2-homology-3）結合溝的抗凋亡蛋白：Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、CED9等，具有抗凋亡作用；②含有3個結構域BH1-3的促凋亡蛋白Bax、Bak、Bok等，發揮促凋亡作用；③僅含有BH3的促凋亡蛋白，如Bik、Bid、Bim等[7]，可通過與Bcl-2蛋白結合，從而釋放促凋亡蛋白，或直接激活促凋亡蛋白，從而促進凋亡的發生（圖1[10]）。Bcl-2家族被認為是三方凋亡開關，它通過家族內部成員的相互作用實現對細胞凋亡的調控，抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間的平衡決定細胞的存活或死亡[8]。其中，抗凋亡蛋白Bcl-2因具有拮抗細胞凋亡的功能而被醫學界廣泛熟知。近年來，抗凋亡蛋白Bcl-2在抑制自噬方面的作用受到越來越多的關注，它可通過與自噬相關蛋白Beclin1結合，抑制細胞自噬的發生[9]。Bcl-2的這種抗自噬功能對細胞發揮保護作用，可通過抑制Beclin1突變體誘導的過度自噬維持細胞的存活。

圖1 Bcl-2家族分類及結構圖

2 Beclin1

Beclin1，也稱BECN1基因，是酵母自噬相關基因Atg6/Vps30的哺乳動物同源基因，位于人類染色體17q21位點，蛋白分子質量約為60kD，主要定位于細胞質結構，如內質網（ER）和線粒體內。Beclin1是首個被鑒定的介導哺乳動物自噬的基因，是細胞自噬的一個關鍵調控因子，它可招募自噬關鍵蛋白到自噬體前體，與Vps34和ps15形成復合物[11]，調節細胞內自噬的活性。Beclin1含有450個氨基酸，形成3個結構域：Bcl-2結合部位、螺旋-螺旋結構域（coiled-coil domain，CCD）及進化保守結構域（evolutionarily conserved domain，ECD）。此外，Beclin1還含有富含亮氨酸的氨基酸序列，負責有效地核輸出信號（NES）[12]（圖2）。許多自噬調控蛋白通過與Beclin1不同結構域相結合，形成蛋白復合體調控自噬水平。凋亡抑制因子Bcl-2同樣可以通過BH3結構域與Beclin1結合，阻止Beclin1依賴的細胞自噬的發生，導致細胞凋亡。因此，Beclin1通過與自噬相關蛋白結合或與凋亡相關蛋白結合決定細胞發生自噬或凋亡[13]。

圖2 Beclin1結構圖

3 Bcl-2/Beclin1復合物對細胞調亡和自噬的調控作用

凋亡和自噬在維持細胞自穩態中發揮著重要作用，二者之間存在著錯綜復雜的關系[14]。目前認為，在介導細胞死亡的過程中，凋亡和自噬可能存在以下幾種關系[13]：①兩種程序同時或者先后啟動，協同促進細胞的死亡；②自噬抑制凋亡的發生，自噬通過清除受損細胞器或蛋白，為細胞重新供能，使細胞免于凋亡；③自噬促進凋亡相關特征的顯現，但并不作為誘發細胞死亡的直接原因。多種調控元件（如鞘脂、神經酰胺、MAPk、DRP-1等）及信號通路（如PI3K/Akt信號通路）參與了對細胞凋亡和自噬的調控[15]，而Bcl-2/Beclin1復合物在凋亡和自噬的發生發展中起到了“切換開關”的作用[16]，它決定著細胞是進入凋亡程序還是啟動自噬程序。Beclin1可以通過其BH3結構域與Bcl-2蛋白結合，使Bcl-2與促凋亡蛋白Bax解離，從而激活細胞凋亡；而Beclin1與Bcl-2的結合同時阻斷了Beclin1對自噬前體的作用，從而抑制了自噬的發生[17]。

3.1 Beclin1和Bcl-2的表達水平對凋亡和自噬的影響 目前，關于Beclin1和Bcl-2的表達水平對凋亡和自噬的影響，主要集中在腫瘤的發生機制和腫瘤耐藥性的研究。研究發現，在許多腫瘤疾病中Beclin1的表達水平顯著降低，而Bcl-2的表達水平則明顯上調[18-19]。Beclin1低表達導致自噬清除受損細胞器的能力下降，產生大量活性氧及基因毒性應激，從而導致細胞轉化。臨床研究表明，40%～75%的乳腺癌和卵巢癌中存在Beclin1蛋白的丟失，Beclin1蛋白的丟失可能使腫瘤細胞逃避自噬性死亡，從而促進腫瘤細胞的存活[20]。但在直腸癌中，Beclin1卻呈現高表達，采用RNAi技術抑制直腸癌細胞Beclin1的表達后，可有效抑制直腸癌細胞的自噬及增殖，促進直腸癌細胞凋亡[21]。這些研究結果表明，Beclin1可通過影響細胞自噬與凋亡，從而影響腫瘤的發生與預后，但Beclin1調控腫瘤細胞凋亡和自噬的具體機制尚未明確。Bcl-2不僅具有抗凋亡作用，同時還可通過與Beclin1相互作用，發揮抑制自噬的作用。在MCF-7細胞中，LIMA等[22]通過RNA干擾技術下調Bcl-2表達誘導的細胞死亡較對照組升高了50%，而其中凋亡僅占該細胞死亡的11%，因此，該研究認為，自噬性細胞死亡可能是造成額外細胞死亡的原因之一。Beclin1的基礎表達可使機體在應對應激刺激做時首先做出自噬反應，從而抑制細胞凋亡的出現；但當Beclin1的表達下調或缺失時，可導致細胞自噬功能異常，從而誘導細胞凋亡性死亡的發生[23]。與在MCF-7人乳腺癌細胞系和U87人膠質瘤細胞系的研究中得出的結果相似，在肥厚性瘢痕成纖維細胞的研究中證實，過表達的Bcl-2會抑制Beclin1表達的升高及自噬體的形成，而下調Bcl-2的表達則有助于Beclin1的激活和自噬的發生[24]。在HEPG2肝癌細胞系中，采用ABT737抑制Bcl-2的表達導致促凋亡相關基因及自噬相關基因（如Beclin1、LC3等）表達升高，誘導細胞自噬的激活以及細胞的死亡[25]。

3.2 Bcl-2/Beclin1復合物的細胞定位及其所結合的因子對凋亡和自噬的影響 Bcl-2/Beclin1的相互作用對凋亡和自噬的影響，除了受Bcl-2和Beclin1表達水平的影響外，同時還受細胞定位的影響。研究表明，Bcl-2和Beclin1的相互作用存在于內質網和線粒體之中[26]，但只有定位于內質網的Beclin1和Bcl-2相互作用對自噬具有調節作用，而定位于線粒體的Bcl-2則主要發揮對細胞凋亡的調節作用，無調控自噬的功能[27]。

除受細胞定位的影響外，與Bcl-2和Beclin1相結合的因子對Bcl-2/Beclin1的切換開關作用也有重要影響。Beclin1和Bcl-2可與其它的自噬調節蛋白在不同的細胞位置形成復合物，從而影響凋亡和自噬的進程。研究證實，自噬相關蛋白AMBRA1（activating molecule in Beclin1-regulated autophagy）作為一個自噬的關鍵調節因子，與Beclin1和Bcl-2均能相互作用。當受到自噬刺激時，磷酸化自噬相關基因Ulk1（unc-51 like kinase 1）磷酸化AMBRA1，從而使AMBRA1從動力蛋白復合體（dynein motor complex）中分離，分離后的AMBRA1易位到內質網，與自噬啟動復合體中的Beclin1結合，從而導致細胞自噬的發生[28]。高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）是一種Beclin1結合蛋白，對維持自噬起著重要作用，它能夠和Bcl-2競爭與Beclin1的相互作用，并將Beclin1定位于自噬體。Bcl-2/E1B-19kDa相互作用蛋白3（BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3，BNIP3），是另一種通過與Bcl-2結合，從而抑制Bcl-2與Beclin1形成復合物的蛋白質，它通過其BH3結構域與Bcl-2結合，從而使Bcl-2/Beclin1解離，激活細胞自噬[29]。

3.3 Bcl-2/Beclin1通過Ser/Thr蛋白激酶調控凋亡和自噬 除受細胞定位和結合因子的影響外，Ser/Thr激酶，包括死亡相關蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）、JUN N-末端激酶1（c-Jun N-terminal protein kinase 1，JNK1）和AKT（也稱為PKB），均參與了對Bcl-2/Beclin1復合物的調控[30]。DAPK在BH3結構域（Thr119）對Beclin1進行磷酸化，從而誘導Bcl-2/Beclin1復合物的解離，最終促進自噬的發生；還有研究還發現，DAPK能夠通過調節Bcl-2/Bax的表達水平，從而誘導內皮細胞凋亡的發生[31]。凋亡和自噬進程還受JNK1介導的Bcl-2磷酸化的調節[32]。WEI等[33]研究發現，在營養缺乏的情況下，JNK1蛋白被激活，并導致Bcl-2位于BH4和BH3結構域之間的包括Thr69、Ser70、Ser87在內的多個殘基磷酸化。但根據營養缺乏持續時間的不同，JNK1介導的Bcl-2磷酸化對凋亡和自噬的影響也不同。JNK1介導的Bcl-2的快速磷酸化可以通過解離Bcl-2/Beclin1復合物激活自噬，從而促進細胞存活；但當營養缺乏16h后，JNK1介導的Bcl-2磷酸化就轉變為解離Bcl-2/Bax復合物，從而激活Caspase-3凋亡信號通路，促進細胞凋亡的發生[34]。另有研究表明，促凋亡蛋白激酶Mst1能夠通過磷酸化Beclin1協調自噬和凋亡的關系，同時調節Bcl-2、Beclin1和Bax三者間的相互作用[35]。

4 小結

細胞凋亡和自噬作為機體的兩種進化保守機制，在維持組織內穩態、機體發育和疾病發生發展過程中發揮著核心作用，二者之間關系密切。受所受到的刺激因素及所處疾病階段的影響，凋亡與自噬相互排斥，又協同發生、同步增強。細胞凋亡和自噬之間存在錯綜復雜的關系，Bcl-2/Beclin1復合物在二者的切換中起著至關重要的作用。Bcl-2/Beclin1復合物可以作為“變阻器”發揮對凋亡和自噬的調節作用，確保凋亡及自噬水平均保持在穩態范圍內，其對凋亡和自噬的調控作用受Bcl-2和Beclin1的表達水平、細胞定位、所結合的因子及Ser/Thr蛋白激酶等多種因素的調控。但是，凋亡和自噬的相互關系十分復雜，不僅受Bcl-2/Beclin1復合物的調節，還受到一些其它信號通路和信號因子的調控。因此，對于凋亡和自噬的關系仍需要進一步深入探討，明確凋亡和自噬間的相互作用，無論是對正常的生長發育過程或是疾病的發生及進展過程都具有重要的意義。