基于ITS2序列的金蓮花種子DNA條形碼鑒定研究*

王金燦，王春淼，趙 晴，馮麗肖，石林春，劉金欣、△

(1.承德醫學院中藥研究所/河北省中藥研究與開發重點實驗室，河北承德 067000；2.中國醫學科學院/北京協和醫學院藥用植物研究所）

金蓮花為毛茛科植物金蓮花Trollius chinensisBunge.的干燥花，味苦、微寒，主治上呼吸道感染[1]。在我國金蓮花有16種，分布于河北、山西等地，其中以河北省承德壩上所產的金蓮花藥材最佳[2]。金蓮花的藥用價值較高，但其野生資源不足，難以滿足市場需求，需要大規模人工種植。而種子是中藥材種植的源頭，因此保障金蓮花種子的真偽就顯得尤其重要。由于金蓮花種子的形態學特征不明顯，無法使用傳統的方法來判斷金蓮花種子的真偽。DNA條形碼分子鑒定技術是利用基因組中一段公認的、相對較短的DNA序列，來進行物種鑒定的一種分子生物學技術，這項技術幾乎不受環境、被鑒定物形態等情況的影響，可以很好彌補傳統鑒定方法的不足[3-5]。DNA條形碼分子鑒定技術已經成功鑒定了桔梗[6]、黃芩[7]、知母[8]等中藥材的種子，但對金蓮花種子的鑒定尚未有研究。本研究以金蓮花種子為研究對象，采用DNA條形碼技術對金蓮花種子的基原進行了鑒定，以期為鑒別金蓮花種子的真偽提供依據。

1 儀器與材料

MM400型球磨儀（德國Retsch公司），1-14型離心機（德國Sigma公司），NanoDrop 2000c型超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司），天根植物DNA提取試劑盒（天根生化科技(北京)有限公司），PCR Master Mix試劑（北京艾德萊生物科技有限公司)。

來自金蓮花道地產區河北省承德市和內蒙古自治區的金蓮花種子9份，見表1：

表1 金蓮花種子樣品信息

2 方法與結果

2.1 DNA提取，PCR擴增和測序 從收集到的9份不同產地的金蓮花種子樣品中，每份樣品選取3粒籽粒飽滿的種子，分別進行編號（共27個實驗編號）并使用天根植物DNA提取試劑盒提取單粒種子的DNA，提取操作步驟參照試劑盒說明書進行，使用超微量分光光度計鑒定金蓮花種子DNA的質量。參照《中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則》擴增ITS2序列，PCR產物經純化后，使用測序儀進行雙向測序，并參照《中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則》判斷測序峰圖質量。

結果顯示27個實驗樣品的DNA濃度平均值為26.2g/μl，DNA的A260/A280位于1.8～2.0之間，A260/A230的平均值約為1.18，說明所提取的DNA純度較高。采用瓊脂糖凝膠電泳法和凝膠成像法檢測PCR擴增產物，所得電泳見圖1，在480bp的位置上有明顯條帶。雙向測序所得測序峰圖分離程度高，無重疊峰出現，可進行序列拼接獲取ITS2序列。

圖1 瓊脂糖凝膠成像電泳圖譜

2.2 序列比對、NJ系統發育樹構建和BLAST分析 利用Muscle 3.8軟件進行多序列比對，用中藥材DNA條形碼鑒定系統（http：//www.tcmbarcode.cn）進行BLAST鑒定分析，利用MEGA 7.0軟件構建NJ系統發育樹，使用BLAST法和NJ系統發育樹法進行物種鑒定。

9份金蓮花種子樣品，每份樣品選取3粒，共獲得27條ITS2序列，相關序列已提交至NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）。基于建立的金蓮花ITS2條形碼數據庫，分別使用NJ系統發育樹法和BLAST方法進行基原物種鑒定。由NJ系統發育樹可知，所有樣品分為兩支，JLHZ03（Z31、Z32、Z33）和JLHZ04（Z41、Z42、Z43）單獨聚為一支，與其它樣品區分明確（圖2）；經BLAST比對后可鑒定出JLHZ03和JLHZ04為播娘蒿，其余序列可鑒定為金蓮花。

圖2 金蓮花種子樣品NJ系統發育樹

3 討論

本研究結果顯示除JLHZ03和JLHZ04兩份樣品為播娘蒿外，其余7份金蓮花種子均為正品。金蓮花可清熱解毒，主治上呼吸道感染、扁桃體炎等疾病，其中以治療上呼吸道感染最為有效，具有較高的醫用價值[1]。然而，金蓮花在自然狀態下根的再生能力差，僅靠種子繁殖，但其種子常隨著藥用部位—花的被采摘使用而遺失，因此造成了種質資源的流失[9]，而金蓮花的這種特點導致目前市場上金蓮花種子的市售價格較高（平均900元/斤）。播娘蒿在除華南外全國各地均可生產，資源充足，因此其種子的市售價格遠低于金蓮花種子，且與金蓮花種子外觀形態相似，難以通過形態特征進行區分，部分商家為了追逐利益在金蓮花種子中混入了播娘蒿種子。根據2015版《中國藥典》[10]記載，播娘蒿以種子入藥，藥材名為葶藶子，葶藶子可以瀉肺平喘、行水消腫，與金蓮花的功效截然不同。在金蓮花種子中混入播娘蒿種子不僅會給農戶造成嚴重的經濟損失，還會增加臨床安全用藥的風險。

然而，金蓮花種子的形態學特征不明顯，無明顯的種臍等特征，傳統的形態鑒定方法在鑒定金蓮花種子上存在一定的局限性，因此亟需一種新的手段來鑒定金蓮花種子。DNA條形碼分子鑒定技術顯著推動了分類學的發展[11-12]，同時中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則已經成功納入2015年版《中國藥典》[13]，中藥材DNA條形碼分子鑒定技術也已經深入到中藥材生產的源頭-中藥材種子的鑒定研究[6]。本研究以市售金蓮花種子為研究對象，基于ITS2序列對其基原進行鑒定，結果顯示ITS2序列可以用于鑒定金蓮花種子。因此，本研究可為在源頭上保證金蓮花物種子的真偽提供依據。