Ⅲ期-Ⅳ期預后不佳DN患者血清蛋白標志物分析*

劉垠浩，陳麗貞

（福建中醫藥大學附屬漳州市中醫院，福建漳州 363000）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是一種由糖尿病引發、以腎臟微小血管病變為主要表現的一種慢性疾病。DN時顯微鏡下可見腎小球硬化、基底膜增厚、系膜基質增多，臨床上多表現為不同程度蛋白尿，可伴高血壓和浮腫，腎功能將隨著疾病發展逐漸惡化。目前，醫學界仍未能完全闡明DN的具體發病機制，故難以找到有效的根治方法。尿微量白蛋白（urinary microalbumin，MALB）在很長一段時間里，被認為是診斷DN的無創傷性生物學標記物[1]，但眾多研究發現其診斷的特異性及準確性并不理想。周紅梅[2]對60例DN患者的MALB進行檢測，結果顯示陽性率僅為53.3%；朱曉英等[3]研究顯示，MALB對早期DN檢驗的靈敏度為67.5%，特異度為89.6%。因此，迫切需要找到更有效的辦法來診斷DN。

“蛋白質組學”的概念于上世紀90年代被首次提出[4]，它將基因所表達的蛋白質作為一個整體進行研究。隨著科技的高速發展，目前該技術逐漸成熟，眾多學者紛紛將其運用于DN領域的研究，試圖尋找出診斷DN更加敏感及特異性的標志物[5-6]。本研究運用表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜技術（surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI技術）檢測了Ⅲ期-Ⅳ期DN患者及健康者血清，通過篩選組間差異蛋白，從蛋白質水平探討了DN預后不佳的血清標志物。

1 資料與方法

1.1 入選標準 ⑴診斷標準：DN的診斷采用《中國糖尿病防治指南》中“糖尿病腎病的表現及分期”標準[7]。⑵納入標準：符合診斷標準；年齡≥18歲或≤70歲；運動+飲食+西藥降糖治療1周后，空腹血糖≤7.8mmol/L和餐后2h血糖＜10mmol/L者，或糖化血紅蛋白≤7.5%；腎小球濾過率60～130ml/min或24h尿蛋白定量≤3.5g；血壓控制在＜180/110mmHg；接受并簽署知情同意書。⑶排除標準：其它原因所致的尿蛋白增多者(如泌尿系感染、高血壓、免疫疾患、心力衰竭等)；合并乙肝、結核等傳染性疾病，肝功能異常者；糖尿病酮癥酸中毒者；被醫生判定不宜納入研究者。

1.2 一般資料 2017年1月-2018年6月符合入選標準的50例住院Ⅲ期-Ⅳ期DN患者的血清標本，分為預后不佳組和預后良好組。預后不佳組滿足以下≥3個條件[8-9]：尿白蛋白排泄率＞30mg/d，腎小球濾過率＜90ml/min，顯微鏡下見K2W結節，臨床出現血壓輕至中度升高，伴不同程度的水腫。

采集同期25例健康體檢者血清標本作為對照組。三組在性別、年齡等方面比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1：

表1 三組受試者一般資料比較(±s )

表1 三組受試者一般資料比較(±s )

組別 n 男 女 年齡/歲 病程（年）預后不佳組 27 14 13 45.00±18.76 8.53±5.49預后良好組 23 11 12 38.60±14.87 6.28±3.11正常對照組 25 10 15 47.14±17.05 ——

1.3 標本、芯片的處理及數據的處理 將制備好的血清加入含適量裂解液的EP管中，4℃下靜置30分鐘后加入緩沖液，吹打血清樣品；芯片每孔加入緩沖液震蕩處理后每孔加入制備好的血清樣品100μl，4℃震蕩1小時、甩出樣品；將200μl的結合緩沖液加入芯片，室溫震蕩5分鐘，甩出液體，共操作2次；每孔加入200μl去離子水后甩出；將基質物質(SPA，芥子酸)同富集的蛋白液混合，而后將其加到蛋白芯片上風干，直至達到共結晶狀態；最后使用SELDI-TOFMS質譜儀（美國Ciphergen Biosystems Inc公司）檢測。

采用Ciphergen ProteinChip、Biomarker WizardTM和Biomarker PatternsTM Software等軟件進行數據的收集和分析，最終由BPS軟件處理后生成結果。

1.4 統計分析 采用SPSS 19.0軟件進行數據的統計分析。各組檢測數據用（±s）表示，組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DN預后不佳組與正常對照組比較 27例DN預后不佳組與25例正常對照組質荷比（M/Z）數據對比后顯示，M/Z為2687.14、3125.76、5904.29、7928.55和11401.03的這5個蛋白質的荷比峰比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1、表2：

表2 DN預后不佳組與正常對照組質荷比數據比較（±s ）

M/Z(Da) DN預后不佳組（n=27） 正常對照組（n=25） P 2687.14 2.94±2.65 0.91±0.42 0.030 3125.76 5.24±3.06 0.87±1.11 0.042 5904.29 2.23±1.96 0.71±0.58 0.035 7928.55 3.71±2.06 1.38±1.19 0.040 11401.03 4.49±2.74 1.55±0.88 0.020

2.2 DN預后良好組與正常對照組比較 23例DN預后良好組與25例正常對照組M/Z數據對比后顯示，M/Z為3729.41、7928.55的這2個蛋白質的荷比峰比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3：

表3 DN預后良好組與正常對照組質荷比數據比較（±s ）

表3 DN預后良好組與正常對照組質荷比數據比較（±s ）

M/Z(Da) DN預后良好組（n=23） 正常對照組（n=25） P 3729.41 3.77±2.42 0.87±1.16 0.040 7928.55 6.53±7.07 3.05±2.34 0.030

2.3 DN預后不佳組與預后良好組比較 27例DN預后不佳組與23例預后良好組M/Z數據對比后顯示，M/Z為3125.76、4237.91、6678.24和13754.80的這4個蛋白質的荷比峰比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2、表4：

表4 DN預后不佳組與預后良好組質荷比數據比較（±s ）

表4 DN預后不佳組與預后良好組質荷比數據比較（±s ）

M/Z(Da) 預后不佳組（n=27） 預后良好組（n=23） P 3125.76 2.48±4.51 1.19±1.07 0.030 4237.91 3.01±2.54 1.42±0.63 0.020 6678.24 4.45±3.98 0.78±1.12 0.040 13754.80 1.31±0.92 0.57±0.34 0.035

圖2 DN預后不佳組與預后良好組蛋白質指紋圖譜

3 討論

蛋白質是構成人體組織的重要成分，發生疾病時必然伴隨著蛋白質的變化，因此，蛋白質的變化可能為闡明疾病的發生機制和疾病的治療提供新途徑。蛋白組學的研究方法通過整體層面觀察蛋白質的特性、表達和相互作用，能全面實現對細胞、器官甚至生命體的研究[10]。眾多疾病均可導致血液中的蛋白質發生變化，且血液標本采集方便，容易被患者接受，利用血液標本結合SELDI技術實現疾病的早期診療，已成為當今醫學界的研究熱點。

DN是導致終末期腎臟病的主要原因之一，蛋白尿、高血壓是公認的影響DN預后的危險因素[11-12]，且腎小球濾過率及病理分型在一定層面上可預測DN病情的進展速度和預后。安玉等[8]研究顯示，DN患者隨著腎小球病變的加重，蛋白尿逐漸增加，腎小球濾過率逐漸下降；MISE等[9]對205例DN患者的研究顯示，腎小球病變分級與腎臟預后有關，隨著腎小球病變加重，腎臟預后逐漸變差。因此，本研究利用尿白蛋白排泄率、腎小球濾過率、腎臟病理分級、血壓升高程度、是否浮腫等作為主要參考指標與判定入選病人的標準，再對入選病人進行分組，試圖尋找Ⅲ期-Ⅳ期DN患者預后不佳的差異蛋白。本研究結果顯示，DN預后良好組與正常對照組比較，存在2個呈現高表達狀態的差異蛋白；DN預后良好組與預后不佳組比較，存在4個呈現高表達狀態的差異蛋白；DN預后不佳組與正常對照組比較，存在5個呈現高表達狀態的差異蛋白。在排除了“背景噪音”、儀器最佳分辨度等方面存在誤差的影響后，M/Z為3125.76Da的蛋白在Ⅲ期-Ⅳ期DN預后不佳組呈現特異高表達，且明顯高于正常對照組與預后良好組。

雖然蛋白組學技術為探索疾病的發生機制和診療方法提供了新的平臺，但仍有不足之處。首先，國際上應盡快制定統一評價標準來規范樣本的制備；其次，蛋白組學的檢測技術在操作過程中易被核酸干擾，而且測定混合有機成分時較不準確[13]；第三，數據統計處理方式仍有提高空間；第四，蛋白質數據庫目前規模有限，難以提供較為完整準確的數據查詢。但是蛋白組學廣闊的研究方向及應用前景，值得繼續深入探索。