喉鱗狀細胞癌組織中USP18、BTG3表達變化及與預后的相關性

朱新華,曹鵬

(泰興市人民醫院，江蘇泰興225400)

喉癌的發生發展是多步驟、多階段的復雜過程，其機制尚未完全闡明[1，2]。泛素特異性蛋白酶18(USP18)是一種干擾素信號通路負調節器，控制著Ⅰ型和Ⅲ型干擾素通路，其高表達可促進細胞異常增殖，并影響T淋巴細胞的凋亡途徑[3]。B細胞轉位基因3(BTG3)是近年來發現的抗增殖基因家族成員，參與修復損傷基因、維持基因穩定等過個過程，其低表達可促進癌細胞的增殖、侵襲能力[4]。USP18、BTG3與多種腫瘤的發生發展有關[5，6]，但二者在喉鱗狀細胞癌中的作用尚不明確。本研究通過檢測喉鱗狀細胞癌組織中USP18、BTG3的表達，并分析二者與臨床病理特征、預后的相關性，旨在為臨床診療及預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年1月～2015年7月在我院行手術切除治療的喉鱗狀細胞癌患者82例，男44例、女38例，年齡≥60歲42例、<60歲40例，腫瘤直徑≥3 cm 40例、<3 cm 42例，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期44例、Ⅲ～Ⅳ期38例，聲門上型24例、聲門型38例、聲門下型20例，分化程度高分化40例、中低分化42例，淋巴結轉移45例、無淋巴結轉移37例。術中另收集50例患者距腫瘤邊緣1 cm以上的正常喉黏膜組織作為對照，男27例、女23例，年齡≥60歲29例、<60歲21例。患者術前均未行放、化療，術后病理檢查證實腫瘤組織為喉鱗狀細胞癌、癌旁組織為正常喉黏膜組織，排除其他部位腫瘤或嚴重器質性病變。本研究經醫院倫理委員會審核通過，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 USP18、BTG3檢測方法 采用免疫組化法。收集手術切除的腫瘤組織和癌旁組織標本，加入4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續切4 μm厚切片；常規脫蠟、脫水，檸檬酸高壓修復；滴加相應的一抗，4 ℃過夜，PBS沖洗；滴加二抗，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。以已知陽性喉鱗狀細胞癌標本作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。USP18、BTG3均為細胞質和細胞核表達。隨機選取5個高倍鏡視野，根據陽性細胞所占比例及染色程度進行評分。陽性細胞所占比例評分：無陽性細胞為0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>76%為4分。染色程度評分：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淡黃色為1分，無色為0分。兩項評分的乘積≥2為高表達，<2為低表達。

1.3 預后觀察方法 每3個月隨訪1次，隨訪內容包括是否復發、復發時間、是否死亡、死亡時間。隨訪截止日期為2018年8月。總生存期定義為患者術后至任何原因導致死亡的時間，無進展生存期定義為患者術后到腫瘤復發的時間，總生存率定義為隨訪結束時未死亡患者占總患者例數的比率，無進展生存率定義為隨訪結束時疾病無進展患者例數占總患者例數的比率。

1.4 統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件。計數資料以百分數表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存時間曲線，以Log-Rank檢驗進行比較。單因素及多因素回歸分析采用COX比例風險模型。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 USP18、BTG3在喉鱗狀細胞癌組織和癌旁正常組織中的表達比較 喉鱗狀細胞癌組織中USP18、BTG3高表達率分別為37.80%(31/82)、45.12%(37/82)，癌旁正常組織分別為12.00%(6/50)、82.00%(41/50)。喉鱗狀細胞癌組織中USP18高表達率高于癌旁正常組織，BTG3高表達率低于癌旁正常組織(P均<0.05)。

2.2 USP18、BTG3表達與喉鱗狀細胞癌患者臨床病理參數的關系 腫瘤直徑≥3 cm、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、中低分化、合并淋巴結轉移患者USP18高表達率低于腫瘤直徑<3 cm、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、高分化、無淋巴結轉移患者(P均<0.05)；腫瘤高分化、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移患者BTG3高表達率高于腫瘤中低分化、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、合并淋巴結轉移患者(P均<0.05)。見表1。

2.3 USP18、BTG3高表達與喉鱗狀細胞癌患者預后的關系 USP18低表達患者的3年總生存率為90.32%(28/31)，3年無進展生存率為80.66%(25/31)，高于USP18高表達患者的68.63%(35/51)、56.86%(29/51)(P均<0.05)。BTG3高表達患者的3年總生存率為89.19%(33/37)，3年無進展生存率為83.78%(31/37)，高于BTG3低表達患者的71.11%(32/45)、60.00%(27/45)(P均<0.05)。

2.4 影響喉鱗狀細胞癌患者生存時間的單因素和多因素回歸分析結果 單因素COX分析結果顯示，腫瘤分化程度、腫瘤直徑、臨床分期、USP18高表達、BTG3低表達與患者的生存時間有關，見表2。進一步行多因素分析結果顯示，腫瘤臨床分期、分化程度、USP18高表達、BTG3低表達是患者生存時間的影響因素(P均<0.05)，見表3。

表1 不同臨床病理參數的喉鱗狀細胞癌患者USP18、BTG3高表達率比較(%)

表2 影響喉鱗狀細胞癌患者生存時間的單因素COX回歸分析結果

表3 影響喉鱗狀細胞癌患者生存時間的多因素COX回歸分析結果

3 討論

喉癌的組織學類類型大部分為鱗狀細胞癌，其具體的發病原因及機制尚未闡明[7]。BTG3是抗增殖蛋白家族易位基因成員，位于第21號染色體長臂1區1帶和2區1帶，是p53的下游靶標，并在p53基因毒性應激中被誘導，在多種生理病理過程中發揮作用，如細胞周期的調節、細胞分化等，其表達水平下調將導致細胞異常增殖，導致腫瘤的發生，其水平上調可阻止細胞從G0/G1期到S期。USP18是泛素系統的重要成員，具有抑制細胞凋亡、介導多種蛋白泛素化等功能。研究顯示，USP18和BTG3與多種腫瘤的發生發展及轉歸有關[8，9]。

易禮智等[10]報道，USP18的表達水平與結直腸癌分化程度、淋巴結轉移以及遠處轉移顯著相關。布力布·吉力斯漢等[11]報道，USP18的表達狀態與腫瘤的分期、浸潤深度及是否淋巴結轉移有關。本研究結果顯示，腫瘤直徑≥3 cm、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、中低分化、合并淋巴結轉移患者USP18高表達率低于腫瘤直徑<3 cm、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、高分化、無淋巴結轉移患者，表明USP18高表達患者的腫瘤分化程度較低，腫瘤分期較晚，預示著這些患者的預后更差，復發和轉移的可能性更大。而這些患者的腫瘤直徑更小，提示這些患者出現明顯臨床癥狀的時間更晚，及時發現和明確診斷的時間更晚。USP18高表達患者更多發生淋巴結轉移，同樣預示USP18高表達患者的預后較差。

鄭華川等[12]報道，BTG3過表達參與腫瘤細胞增殖、誘導細胞周期S/G2期阻滯、分化和自噬等過程，且其表達狀態與腫瘤的轉移有關。呂赤等[13]報道，BTG3的表達狀態與結腸癌的組織學類型及分化程度有關。本研究結果顯示，腫瘤高分化、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移患者BTG3高表達率高于腫瘤中低分化、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、合并淋巴結轉移患者。

研究顯示，USP18和BTG3的表達狀態與腫瘤患者的生存時間顯著相關。本研究結果顯示，USP18低表達患者的3年無進展生存期和總生存期均優于USP18高表達患者。關于USP18低表達患者預后較高表達患者更好的原因:Zheng等[14]認為，USP18表達下調可抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移，并可增強化療藥物的治療效果，從而改善這部分腫瘤患者的預后；Yawen等[15]則認為，USP18通過上調EGFR和激活AKT/SKP2途徑來促進腫瘤的生長;Duex等[16]研究顯示，USP18低表達可促進miR-7表達上調，miR-7反過來抑制EGFR表達和癌細胞的致瘤活性，影響患者預后;另外有研究認為，USP18可將泛蛋白樣蛋白ISG15與靶蛋白解偶聯，且作為Ⅰ型干擾素反應的主要負調節劑，限制由Ⅰ型IFN和藥物引發的外源性凋亡途徑[17]，影響抗腫瘤藥物的治療效果。

本研究結果顯示，BTG3高表達患者的3年無進展生存期和總生存期均優于BTG3低表達患者。其機制可能與BTG3高表達上調細胞周期蛋白E、p16、p27、NF-κB、p38 α/β、XIAP、Bcl-2、ATG14、p53等蛋白表達，通過抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡來抑制腫瘤細胞的生長和轉移有關[18]。單因素和多因素COX回歸分析顯示，除腫瘤分期和腫瘤分化程度外，USP18高表達和BTG3低表達均為影響喉鱗狀細胞癌患者生存時間的危險因素。因此，USP18和BTG3均可能成為喉鱗狀細胞癌患者的治療靶點，通過多種途徑抑制或阻斷兩者的功能，控制病情的進展，改善患者的預后。另外，對于喉鱗狀細胞癌患者，可通過檢測USP18和BTG3的表達狀態，對患者的預后進行評估。

綜上所述，喉鱗狀細胞癌組織中USP18表達升高，BTG3表達降低；USP18、BTG3表達狀態與臨床病理特征具有明顯相關性，USP18高表達、BTG3低表達是影響喉鱗狀細胞癌患者預后的危險因素。