扶芳藤總黃酮提取條件及其對衰老小鼠血清和心肌組織CAT、T-AOC、GSH-Px活性的影響

張明，溫奇龍，汪琴，蔡丹昭

(廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧 530021)

衰老是分子、細(xì)胞、器官功能乃至整個機(jī)體持續(xù)性積累各種功能損傷的綜合復(fù)雜的生理、病理變化過程[1]，是糖尿病、高血壓、高血脂以及心腦血管疾病和一些神經(jīng)功能性退化疾病如阿爾茨海默病等疾病的獨(dú)立危險因素。對衰老及衰老相關(guān)疾病的研究一直是生命科學(xué)領(lǐng)域最為重要的問題之一。近年來各國學(xué)者在抗衰老的研究中相繼提出200多種衰老學(xué)說，其中公認(rèn)的有自由基學(xué)說、代謝學(xué)說和免疫系統(tǒng)退化學(xué)說等[2，3]。研究顯示，扶芳藤提取物具有抗氧化、清除自由基、抗菌、降壓等生物學(xué)活性[4]，提示扶芳藤提取物可能通過提高抗氧化能力起到抗衰老作用。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，扶芳藤提取物的主要成分為黃酮類化合物，但在扶芳藤總黃酮的提取和功效研究方面報道較少。2017年3月～2018年6月，我們通過比較實(shí)驗室不同條件下扶芳藤醇提物總黃酮的提取率，篩選最適提取條件；建立D-半乳糖衰老小鼠模型，觀察扶芳藤總黃酮提取物對小鼠血清及心肌組織中抗氧化指標(biāo)[過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)以及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)]的影響，旨在評價扶芳藤總黃酮抗衰老的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與藥品 清潔級健康雄性昆明小鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。常溫環(huán)境、晝夜各12 h、常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗。扶芳藤干燥粉末由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠提供，蘆丁對照品購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 試劑與儀器 D-半乳糖(Solarbio公司)，GSH-Px、CAT、T-AOC檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，考馬斯亮藍(lán)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，大孔樹脂(30266071、國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，無水乙醇、乙酸乙酯、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為國產(chǎn)分析純，羥甲基纖維素鈉為國產(chǎn)化學(xué)純。紫外可見分光光度計(美國BioTek公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(杭州億捷科技有限公司)、防腐臺式循環(huán)水真空泵(鞏義市科瑞儀器有限公司)、臺式高速大容量離心機(jī)(Eppendorf公司)、電熱恒溫水槽(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 扶芳藤總黃酮的提取、分離和純化

1.2.1 總黃酮樣品最佳測定波長的確定[5]精密稱量蘆丁對照品5.00 mg，配制成0.25 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；精確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，加入10 mL容量瓶中，再加入2 mL AlCl3溶液，混勻后靜置6 min；精確加入3 mL NaAc緩沖液，混勻靜置顯色15 min；加入60%乙醇溶液定容，上下顛倒容量瓶混勻。采用同樣方法配制總黃酮樣品溶液。以60%乙醇溶液作為空白對照，用紫外可見分光光度計在波長480～520 nm處進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和總黃酮樣品溶液在510 nm處的吸光度值最高，故選擇510 nm作為總黃酮樣品溶液的測定波長。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[6]精確稱取蘆丁對照品5 mg，加入60%乙醇溶液配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入60%乙醇至5 mL。再分別加入5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaNO2溶液0.50 mL，搖勻，室溫放置6 min；加入10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的AlNO3溶液0.50 mL搖勻，室溫放置6 min；加4%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaOH溶液4.00 mL搖勻，室溫放置15 min。用紫外可見分光光度計在510 nm波長處測定吸光度。以60%乙醇溶液作為參照，以吸光度為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程y=13.243x-0.014 2，R2=0.998 1。

1.2.3 扶芳藤總黃酮提取最適條件的確定 以扶芳藤總黃酮提取率為考察目標(biāo)，選定提取溫度(A)、提取物料比(B)、提取時間(C)3個因素，每個因素分別對應(yīng)設(shè)計3個水平作L9(33)正交實(shí)驗，篩選出扶芳藤總黃酮提取的最適提取條件。正交試驗的因素和水平見表1。

表1 正交試驗的因素與水平

注：A為提取溫度，B為提取物料比，C為提取時間。

1.2.4 扶芳藤總黃酮的提取 取170 g扶芳藤粉末，加入60%乙醇溶液充分溶解，置于超聲波輔助提取罐中，按設(shè)定的超聲功率、時間、溫度進(jìn)行提取。濾液減壓抽濾除濾渣，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫回收乙醇，再用乙酸乙酯萃取3次，萃取液揮干乙酸乙酯后用95%乙醇溶解，大孔樹脂[7]95%乙醇浸泡48 h后裝柱加樣。以1體積35%乙醇洗脫雜質(zhì)，2體積75%乙醇洗脫后，收集黃酮，再用95%乙醇洗柱。將75%乙醇收集到的液體回流揮干、用60%乙醇定容至100 mL，顯色，測定吸光度值。將測得的吸光度代入回歸方程，計算總黃酮濃度，以總黃酮濃度×樣本稀釋倍數(shù)×加入乙醇提取液的體積/粉末樣品質(zhì)量計算總黃酮含量[8]。

1.3 扶芳藤總黃酮對衰老小鼠血清和心肌組織中抗氧化指標(biāo)影響的觀察

1.3.1 動物分組與模型建立 將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和扶芳藤總黃酮低、中、高劑量組，每組各10只。模型組和扶芳藤總黃酮組按0.2 mL/d給予頸背部皮下注射5% D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型，正常組以等量生理鹽水注射，連續(xù)1周。

1.3.2 給藥干預(yù)與標(biāo)本采集 從第3周開始，扶芳藤高、中、低劑量組分別給予0.2、0.4、0.8 g/mL的扶芳藤總黃酮提取液0.3 mL/d灌胃，正常對照組和模型組等量蒸餾水灌胃，連續(xù)4周。最后一次給藥后，禁食不禁水12 h，75%乙醇消毒后，摘取小鼠一側(cè)眼球取血液，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液4 ℃冰箱保存待測。取血后小鼠頸椎脫臼處死，迅速取出心臟，用生理鹽水沖洗，去除脂肪、系膜，冰上勻漿后加入生理鹽水配成10%組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液-20 ℃保存。

1.3.3 血清及心肌組織中CAT、T-AOC、GSH-Px檢測 采用酶法檢測CAT、T-AOC、GSH-Px活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 扶芳藤總黃酮的最適提取條件 正交試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。通過正交實(shí)驗9組試驗條件的比較，經(jīng)正交試驗方差分析，極差大小排序為A>B>C，表明影響扶芳藤總黃酮提取率的三個因素主次順序為提取溫度>提取物料比>提取時間。確定扶芳藤總黃酮提取的最適條件為溫度60 ℃、料液比1∶50、時間30 min。在此試驗條件下進(jìn)行提取得到總黃酮提取率為3.57%，優(yōu)于其他試驗條件(P均<0.01)。

表2 超聲波輔助法提取正交試驗結(jié)果

表3 正交試驗方差分析結(jié)果

2.2 扶芳藤總黃酮提取結(jié)果 按正交實(shí)驗最佳提取條件進(jìn)行扶芳藤總黃酮提取，最終得到濃度為0.8 g/mL、純度68.7%的扶芳藤總黃酮提取物。

2.3 扶芳藤總黃酮對衰老小鼠血清及心肌組織中T-AOC、CAT、GSH-Px活性的影響 見表4、5。

表4 各組血清T-AOC、CAT、GSH-Px活性比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

表5 各組心肌組織T-AOC、CAT、GSH-Px活性比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

黃酮類化合物是一種天然抗氧化劑，具備較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化能力，具有清熱解毒、抗腫瘤、抗氧化及抗炎鎮(zhèn)痛等藥理活性[9，10]。目前對黃酮類化合物的提取方法包括熱水提取法、醇提取法、堿提酸沉法、超臨界CO2萃取等[11]。與傳統(tǒng)的分離純化方法相比較，超聲波輔助提取可破壞植物細(xì)胞，加速黃酮的擴(kuò)散和溶解，有效提高黃酮的提取率，廣泛用于提取植物中的黃酮等活性成分。大孔樹脂吸附分離技術(shù)提取分離中藥有效成分有明顯優(yōu)勢，對苷類、黃酮、萜類、生物堿、內(nèi)脂、有機(jī)酸等的分離純化效果較好。有關(guān)總黃酮的含量測定方法主要是紫外分光光度法。本研究以蘆丁為對照品，采用AlNO3比色法測定總黃酮含量。然后采用超聲波輔助提取-D101大孔樹脂-乙酸乙酯萃取為分離純化方法，正交試驗設(shè)計并最終確定了實(shí)驗室扶芳藤總黃酮提取的最適條件為溫度60 ℃、料液比1∶50、時間30 min，在此條件下提取的扶芳藤總黃酮提取率為3.57%。

既往中藥粗提物研究發(fā)現(xiàn)，扶芳藤粗提物具有一定的抗衰老作用，扶芳藤水提物對家兔心肌缺血再灌注損傷有抑制作用[12]；扶芳藤提取物可提高急性腦缺血再灌注損傷模型大鼠機(jī)體免疫能力，有止血及鎮(zhèn)痛作用[13]。但是，其具體的抗衰老機(jī)制尚不明確。衰老自由基學(xué)說認(rèn)為，機(jī)體在生理情況下不斷產(chǎn)生自由基的同時，也被體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)所清除，隨著年齡的增長，抗氧化系統(tǒng)失去平衡，導(dǎo)致自由基過剩，引起不同程度的細(xì)胞毒性及瞬時的不可逆損傷，進(jìn)而加速機(jī)體的衰老和死亡[14，15]。

D-半乳糖所致的衰老模型是目前國內(nèi)公認(rèn)的衰老動物模型，大劑量D-半乳糖在醛糖還原酶的催化下被還原成半乳糖醇，半乳糖醇無法被細(xì)胞進(jìn)一步代謝，在細(xì)胞內(nèi)大量堆積，影響正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能障礙、代謝紊亂，同時產(chǎn)生大量超氧自由基，氧化應(yīng)激引起機(jī)體細(xì)胞功能損傷及抗氧化酶活性下降，導(dǎo)致衰老[16]。GSH-Px是機(jī)體中重要的抗氧化酶，是自由基清除系統(tǒng)的重要組成成分[17]；T-AOC可反映機(jī)體總的抗氧化能力，其水平下降表明機(jī)體整體抗氧化能力降低[18]；CAT是催化過氧化氫分解為氧和水的酶，是機(jī)體內(nèi)過氧化氫酶體的標(biāo)志酶。研究結(jié)果顯示，模型組小鼠血清、心肌組織中CAT、T-AOC、GSH-Px活性下降，扶芳藤總黃酮組抗氧化活性升高，且高劑量組各指標(biāo)高于中、低劑量組。這表明扶芳藤總黃酮具有一定的抗氧化性，可提高小鼠的機(jī)體免疫能力，延緩衰老。本研究為進(jìn)一步開發(fā)扶芳藤的抗衰老作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，為抗衰老新藥的開發(fā)提供了依據(jù)。