Gli1抑制劑GANT61對髓母細胞瘤細胞增殖和凋亡的影響

盧恩敏，盧恩娟，高麗京，裴立靜，王慶艷，師翠云

(1唐山市豐潤區人民醫院，河北唐山064000；2唐山市豐潤區第二人民醫院)

SHH信號通路在機體小腦細胞的發育過程中發揮重要作用，該信號通路由SHH配體蛋白Sonic Hedgehog、轉錄因子Gli、跨膜蛋白受體Ptch、跨膜蛋白Smo組成[1]。Gli1是SHH信號通路下游終末端的轉錄因子，調控下游Bcl-2、Cyclin D1、myc等多個靶基因[2～4]。目前研究表明，Gli1和Bcl-2在髓母細胞瘤組織中呈高表達，與淋巴結轉移、組織學分化、病理類型有一定的相關性。Gli1異常激活可促進Bcl-2轉錄活化，從而導致通路持續激活，細胞過度增殖，促進髓母細胞瘤形成[5]。SHH信號通路是影響惡性腫瘤細胞增殖和凋亡的重要影響通路，GANT61是SHH信號通路下游的Gli1抑制劑，可抑制SHH信號通路的激活，也是研究髓母細胞瘤細胞作用機制的重要抑制劑[6]。2017年8月～2019年1月，我們觀察了GANT61調控Gli1和Bcl-2蛋白表達水平對髓母細胞瘤細胞增殖和凋亡的影響，分析髓母細胞瘤發生發展中Gli1和Bcl-2的表達情況及GANT61的作用，旨在為髓母細胞瘤提供有效的治療靶點和治療依據。

1 材料與方法

1.1 材料 髓母細胞瘤Daoy細胞，購自中國醫學科學院基礎醫學研究所。GANT61、RPMI1640培養基購自英國Abcam公司，PCR引物、PCR試劑盒由日本Takara公司提供，Gli1兔多克隆抗體、Bcl-2鼠單克隆抗體、GAPDH鼠單克隆抗體購自英國Abcam公司。CO2培養箱購自上海姚氏儀器培養箱設備廠，流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 細胞培養與分組處理 將Daoy細胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。當細胞生長到70%～80%時，按1∶2～1∶4進行傳代培養。將細胞分為對照組和10、50、100 μmol/L GANT61組，對照組加入0.1% DMSO，10、50、100 μmol/L GANT61組分別加入10、50、100 μmol/L GANT61和0.1% DMSO，均培養24 h。

1.3 細胞增殖抑制率檢測 采用MTT法。收集各組對數生長期細胞，按5×103/孔接種于96孔板，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL繼續培養4 h。加入DMSO 200 μL充分溶解細胞內結晶，上酶標儀于570 nm處檢測個孔吸光度(OD)，以OD570表示細胞增殖情況。增殖抑制率=(對照組OD-實驗組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%。

1.4 細胞凋亡指數檢測 采用流式細胞術。收集各組對數生長期細胞，加入6孔板中。加入胰酶消化，結合緩沖液洗滌，離心去上清。加入結合緩沖液重懸細胞，加入FITC Annexin Ⅴ和PI混勻，避光孵育20 min。1 000 r/min離心5 min，去上清，結合緩沖液洗滌。1 h內上流式細胞儀檢測細胞凋亡指數。

1.5 細胞周期檢測 采用流式細胞術。收集各組對數生長期細胞，離心去上清，PBS清洗重懸細胞后加入1 mg/mL RNaseA 2 μL，37 ℃水浴40 min。將10 μL FITC Annexin Ⅴ和5 μL PI加入200 μL孵育緩沖液中混勻，配成1 μg/mL的標記液。滴加100 μL標記液重懸細胞，室溫避光孵育20 min。離心去上清，上流式細胞儀檢測各周期細胞所占比例。

1.6 細胞中Gli1、Bcl-2 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。使用TRIzol試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列：Gli1上游5′-GGTTCCCAGGTTAGCCCAAG-3′，下游5′-GGTTCCCAGGTTAGCCCAAG-3′；Bcl-2上游5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′，下游5′-TGCATATTGTTTGGGGCAGG-3′；GAPDH上游5′-AATCCCATCACCATCTTCCA-3′，下游5′-TGGACTCCACGACGTACTCA-3′。反應條件：97 ℃ 15 s；95 ℃ 5 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃ 10 min。以GAPDH為內參照，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.7 細胞中Gli1、Bcl-2蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集各組對數生長期細胞，加入裂解液，離心收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。上樣SDS-PAGE膠，加入1∶1 000的Gli1、Bcl-2、GAPDH單抗過夜，TBST洗滌。加入1∶5 000的辣根過氧化物酶標記的二抗IgG室溫孵育1 h，TBST洗滌。將膜置于Imaging System化學發光成像系統進行自動曝光，以目的蛋白與內參蛋白GAPDH的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 對照組和10、50、100 μmol/L GANT61組的細胞增殖抑制率分別為0.43%±0.04%、19.33%±7.17%、34.20%±7.22%、45.20%±5.69%。各濃度GANT61組細胞增殖抑制率均高于對照組，且50、100 μmol/L GANT61組高于10 μmol/L GANT61組，100 μmol/L GANT61組高于50 μmol/L GANT61組(P均<0.05)。

2.2 各組細胞凋亡指數比較 對照組和10、50、100 μmol/L GANT61組的細胞凋亡指數分別為3.09%±0.15%、10.79%±0.34%、22.67%±0.55%、31.30%±0.99%。各濃度GANT61組細胞凋亡指數均高于對照組，且50、100 μmol/L GANT61組高于10 μmol/L GANT61組，100 μmol/L GANT61組高于50 μmol/L GANT61組(P均<0.05)。

2.3 各組細胞周期比較 各濃度GANT61組G1期細胞比例均高于對照組、S期細胞比例均低于對照組，且50、100 μmol/L GANT61組G1期細胞比例高于10 μmol/L GANT61組、S期細胞比例低于10 μmol/L GANT61組，100 μmol/L GANT61組G1期細胞比例高于50 μmol/L GANT61組、S期細胞比例低于50 μmol/L GANT61組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞周期比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與10 μmol/L GANT61組比較，#P<0.05；與50 μmol/L GANT61組比較，△P<0.05。

2.4 各組細胞中Gli1、Bcl-2 mRNA和蛋白表達比較 各濃度GANT61組Gli1、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量均低于對照組，且50、100 μmol/L GANT61組低于10 μmol/L GANT61組，100 μmol/L GANT61組低于50 μmol/L GANT61組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組細胞中Gli1、Bcl-2 mRNA和蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與10 μmol/L GANT61組比較，#P<0.05；與50 μmol/L GANT61組比較，△P<0.05。

3 討論

髓母細胞瘤為原始神經外胚層腫瘤，是最常見的兒童顱內惡性腫瘤之一，多見于10歲以下兒童。髓母細胞瘤的發病機制復雜，涉及到多基因、多信號通路。SHH信號通路是髓母細胞瘤發病機制中常見的通路之一，該通路過度激活可導致髓母細胞瘤細胞異常增殖，進而形成腫瘤[7]。Gli1是SHH信號通路下游終末端的轉錄因子，正常情況下，Ptch跨膜蛋白抑制Smo跨膜蛋白活性，當出現Smo跨膜蛋白異常激活，可促進轉錄因子Gli活化。Gli蛋白家族存在于細胞核和細胞質中，是大分子量C2H2型鋅指結構蛋白，將信號傳送至核內，從而啟動下游靶基因的轉錄，引起SHH信號通路持續激活，導致細胞增殖異常[8]。Gli1是SHH信號通路的激動子，Gli1異常活化是腫瘤細胞增殖生長的重要條件[9]。本研究結果顯示，不同濃度GANT61組細胞增殖抑制率高于對照組，且隨著GANT61濃度升高，細胞增殖抑制率與凋亡指數也隨之升高，表明GANT61能夠抑制髓母細胞瘤細胞增殖并促進髓母細胞瘤細胞凋亡。

Gli1表達水平的高低能反映SHH信號通路激活程度[10]。Gli1異常激活可以促進下游周期蛋白Cyclin D1靶基因轉錄活化，抑制Gli1表達能夠抑制Cyclin D1過度表達，并且抑制腫瘤細胞的增殖生長，促進腫瘤細胞凋亡[11]。本研究顯示，不同濃度GANT61組G1期細胞比例高于對照組，隨著GANT61濃度升高，細胞G1期細胞比例逐漸升高，S期細胞比例逐漸降低，表明GANT61可以引起髓母細胞瘤細胞株G1期阻滯而影響細胞周期。相關研究表明，GANT61能夠阻滯髓母細胞瘤細胞周期G1/S期調控位點，S期及G2/M期細胞顯著減少，G1期細胞數量顯著增多，從而阻滯細胞周期，促進細胞凋亡[12]。也有研究表明，Gli1的異常激活能夠調控下游Cyclin D1高表達，GANT61能夠對Gli1下游基因Cyclin D1進行轉錄表達調控[13]。

Bcl-2基因是位于Gli1下游的一種抑制細胞凋亡的原癌基因，為線粒體膜的整合蛋白，主要存在于線粒體、內質網和核膜上[14]。Bcl-2轉錄表達受Gli1調控。在髓母細胞瘤細胞中，由于存在Gli1的高表達，可導致相應的Bcl-2啟動子依賴因子活躍[15]。高表達的Bcl-2能通過改變線粒體膜通透性來抑制Caspase活化，達到抑制細胞凋亡的作用[16]。本研究結果顯示，不同濃度GANT61組的Gli1、Bcl-2 mRNA和蛋白表達量均低于對照組，隨著GANT61濃度升高，Gli1、Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平隨之降低，表明GANT61能夠抑制髓母細胞瘤細胞Bcl-2 mRNA和蛋白表達。

綜上所述，GANT61能夠抑制髓母細胞瘤細胞的Gli1和Bcl-2基因及蛋白表達，從而抑制細胞增殖，增加G1期細胞比例，促進細胞凋亡。