miR-21在非小細胞肺癌組織細胞中的表達變化及其在細胞增殖、凋亡中的作用

金文靜，顧文超，袁亞平，馮慧麗，王冬冬

(1 上海健康醫(yī)學(xué)院附屬浦東新區(qū)人民醫(yī)院，上海201200；2 上海市浦東醫(yī)院 復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院)

非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌的常見類型，包括鱗癌、腺癌和大細胞肺癌。臨床上肺癌的治療多采用以手術(shù)為主，以放化療、生物治療、中藥治療等為輔的綜合治療，但其5年生存率仍較低[1，2]。微小核糖核酸(microRNA)是一類相對分子質(zhì)量較小的非編碼RNA，因其不能編碼蛋白，曾被認為是基因組中的“廢料”或“垃圾”。近年研究發(fā)現(xiàn)，microRNA可調(diào)控多種基因的表達與功能，從而參與細胞的多種生物學(xué)過程[3]。microRNA-21(miR-21)定位于人類染色體17q23.2上，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有促進作用，被認為是一種促癌基因[4，5]。目前，有關(guān)miR-21在NSCLC發(fā)病中的作用尚不明確，研究結(jié)果也存在一定差異。因此，本研究采用熒光定量PCR法檢測了miR-21在肺癌組織細胞中的表達變化，并觀察了抑制miR-21表達后肺癌細胞、增殖凋亡等生物學(xué)特性的變化，旨在探討其在NSCLC發(fā)病中的作用，為肺癌的診斷與治療提供新的標志物和靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本和細胞 收集上海浦東新區(qū)人民醫(yī)院2017年1月1日～2018年12月31日收治56例NSCLC患者，選取其手術(shù)后存檔的病理組織標本。患者術(shù)前均未行放療、化療及生物治療等抗腫瘤治療，術(shù)中留取肺癌組織及癌旁組織(距離癌組織≥5 cm)，術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。56例NSCLC患者中，男37例、女19例，年齡38～72歲，病理類型為鱗癌40例、腺癌16例，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期38例、Ⅲ～Ⅳ期18例，組織分化程度為高分化20例、中分化25例、低分化11例，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。人NSCLC細胞A549、人正常肺上皮細胞BEAS-2B均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑和儀器 RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司，胰蛋白酶購于上海生物工程有限公司，胎牛血清(FBS)購于杭州四季青生物有限公司；mRNA提取試劑盒購于美國Invitrogen公司，TRIzol Reagent、UItraSYBR Mixture均購于北京康為世紀生物科技公司，Rever Tra Ace qPCR RT Kit購于立陶宛MBI Fermentas公司，miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit購于南京諾唯贊生物科技有限公司；引物序列：miR-21上游引物為5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′、下游引物為5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′，內(nèi)參照U6上游引物為5′-CAGCACATATACTAAAATTGGAACG-3′、下游引物為5′-ACGAATTTGCGTGTCATCC-3′，均由上海吉瑪公司設(shè)計并合成；LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司，抑表達miR-21的反義序列(miR-21 inhibitors：5′-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGU-3′)、無義序列(miR-21-NC：5′-GUCAACAUCAUCAGUCUGAUAAG-CUA-3′)由上海生工生物有限公司設(shè)計并合成；MTT檢測試劑盒購于美國Millipore 公司，流式細胞儀購于美國Becton Dickinson公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織標本處理 取凍存的組織標本約50 mg，粉碎后按mRNA提取試劑盒說明書提取組織總mRNA。采用分光儀測定mRNA濃度，按照濃度稀釋配比后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將A549、BEAS-2B細胞接種于含10% FBS、谷氨酰胺2 mmol/L、青霉素/鏈霉素各100 U/mL的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞融合度≥90%時，用胰蛋白酶消化細胞，以1 000 r/min離心10 min后，去除酶消化液；用PBS重懸細胞后，再次離心后加細胞生長液。將細胞接種于細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2、100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 組織和細胞中miR-21檢測 采用熒光定量PCR法。收集培養(yǎng)24 h的A549、BEAS-2B細胞以及處理后的NSCLC組織和癌旁組織，以熒光定量PCR法檢測miR-21表達。用miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA，按照UltraSYBR Mixture PCR反應(yīng)體系進行擴增。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，53 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共進行40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算miR-21相對表達量。

1.2.4 肺癌細胞分組與轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的A549細胞，用PBS調(diào)整細胞密度為4×104/mL,以1 mL/孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板；細胞呈對數(shù)生長期后，將細胞分為抑制組、無義組和對照組。抑制組、無義組分別按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitors、miR-21-NC，對照組不予轉(zhuǎn)染。將細胞繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后，更換為含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、100%濕度細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.5 細胞增殖情況觀察 采用MTT法。收集各組對數(shù)生長期細胞，用胰蛋白酶消化；完全培養(yǎng)基重懸后，以1.5×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)6個復(fù)孔，共接種5張；置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，從接種后第2天至培養(yǎng)終止前4 h，每孔加入濃度為5 g/L的MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去除培養(yǎng)液，每孔加二甲基亞砜100 μL終止反應(yīng)，檢測波長為490 nm時的光密度(OD)。細胞增殖率=(OD實驗孔-OD對照孔)/OD對照孔×100%。

1.2.6 細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞儀。取各組對數(shù)生長期細胞，加胰蛋白酶消化，用PBS調(diào)整細胞密度為2×106/mL。吸取細胞懸液1 mL置于離心管中，4 ℃下以1 000 r/min離心10 min，去除上清；加入預(yù)冷的PBS 1 mL 重懸細胞，離心后吸棄上清，PBS洗1次；加入Binding Buffer 200 μL 重懸細胞，加入PI和Annexin-V后充分混勻，避光室溫靜置20 min；加300 μL緩沖液，上流式細胞儀檢測凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC和癌旁組織中miR-21表達比較 NSCLC組織中miR-21表達量為2.98±0.99，高于癌旁組織中的1.04±0.32(P<0.01)。

2.2 A549、BEAS-2B細胞中miR-21表達比較 A549細胞中miR-21表達量為3.41±1.03，高于BEAS-2B細胞中的0.94±0.29(P<0.01)。

2.3 不同臨床病理特征NSCLC組織中miR-21表達比較 見表1。

2.4 各組A549細胞增殖率比較 抑制組、無義組、對照組細胞增殖率分別為74.32%±5.67%、95.81%±3.45%、96.43%±3.83%，抑制組細胞增殖率低于無義組和對照組(P均<0.05)，無義組和對照組間細胞增殖率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)。

表1 不同臨床病理特征NSCLC組織中miR-21表達比較

2.5 各組A549細胞凋亡率比較 抑制組、無義組、對照組細胞增殖率分別為32.18%±5.21%、4.56%±2.19%、4.26±1.98%，抑制組細胞凋亡率高于無義組和對照組(P均<0.05)，無義組和對照組間細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)。

3 討論

肺癌的發(fā)生與發(fā)展受多因子、多因素、多階段的控制，其中癌基因的激活和抑癌基因的失活或丟失是其發(fā)生的重要原因[6]。局部和遠處的轉(zhuǎn)移是NSCLC治療中的常見臨床問題，也是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的最主要原因[7～9]。手術(shù)切除是目前NSCLC最主要的治療方法，針對多種目的基因進行靶向治療也能提高其治療效果[10]。但是，由于NSCLC的早期臨床癥狀多不明顯，確診時多已處于晚期，往往錯失手術(shù)治療的最佳時機。因此，尋找新的腫瘤標志物以及治療靶點，對于早期診治NSCLC具有重要意義。

microRNA是一類長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，由細胞內(nèi)源產(chǎn)生的發(fā)夾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄本加工而成。其主要與靶基因3′非編碼區(qū)(UTR)結(jié)合，通過在翻譯水平抑制或斷裂靶標mRNAs而調(diào)節(jié)基因的表達與功能，在細胞的增殖、分化、凋亡等生理過程中發(fā)揮重要作用，其表達異常參也與了腫瘤、動脈粥樣硬化等病理過程[11，12]。miR-21是microRNA家族重要的組成成員之一，由72個核苷酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體剪切加工而成。研究發(fā)現(xiàn)，其基因高度保守，位于蛋白質(zhì)基因間隔，具備自主轉(zhuǎn)錄單位。與大多數(shù)microRNA不同，miR-21具有自己相對獨立的啟動子，其表達不受重疊蛋白編碼基因啟動子的調(diào)控，因此其在基因表達調(diào)節(jié)中可能起重要作用。miR-21廣泛表達于T細胞、B細胞、巨噬細胞、單核細胞及樹突狀細胞等免疫細胞，也可少量表達于造血細胞[13]。近年來，隨著對miR-21研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤組織中表達上調(diào)。本研究采用熒光定量PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中miR-21的表達量高于癌旁組織，人NSCLC細胞A549中miR-21的表達量高于人正常肺上皮細胞BEAS-2B。這與以往研究[14，15]結(jié)果一致，提示miR-21可能在NSCLC的發(fā)病過程中具有促癌作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中miR-21表達與患者的性別、年齡、病理類型及分化程度關(guān)系不大，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；而與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且TNM分期越低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者NSCLC組織中miR-21表達更高。因此，miR-21可作為診斷肺癌的腫瘤標志物和治療靶點進行深入研究。

為進一步明確miR-21在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用，我們通過設(shè)計基因干擾序列以降低miR-21表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與無義組和對照組比較，抑制組細胞增殖率降低、細胞凋亡率升高；無義組和對照組之間細胞增殖率、細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，miR-21在NSCLC的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，同時也為臨床治療NSCLC提供了可靠的分子靶點。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21表達受多種細胞內(nèi)外信號分子的調(diào)控，如全反式維甲酸、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、脂多糖、白細胞介素4等可上調(diào)其表達；此外，在某些特定的細胞類型中，DNA甲基化修飾亦參與miR-21的表達調(diào)控。有研究顯示，卵巢癌OVCAR3細胞經(jīng)DNA甲基化酶抑制劑處理后，細胞高表達miR-21[16]。因此，免疫監(jiān)控失調(diào)以及各種炎性感染在NSCLC的發(fā)生中具有重要作用，應(yīng)在提高患者免疫力的同時減少感染的發(fā)生。microRNA與靶基因3′UTR位點的結(jié)合無需完全配對，因此一個microRNA可調(diào)控多個靶基因。miR-21作為一種促癌microRNA，可通過調(diào)節(jié)下游多個抑癌基因以促進肺癌的發(fā)生與發(fā)展。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，miR-21可通過靶向調(diào)控PTEN、PI3K、PDCD4、BTG2、FasL、TIMP3等多種基因表達，促進細胞增殖以誘發(fā)腫瘤；通過靶向調(diào)控PTEN、TIMP1和TIMP3等基因表達，促進新生血管形成、提高細胞的侵襲遷移能力，從而導(dǎo)致腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移[17，18]。

綜上所述，在NSCLC組織和細胞中miR-21高表達，降低其表達可以抑制細胞增殖、促進細胞凋亡。miR-21在NSCLC的發(fā)病中具有重要作用，有望作為早期診斷肺癌及臨床治療的重要分子靶點。