動物疫病PCR檢測實驗室的污染與對策

翟偉 王秀東 曹凱捷

摘 要 隨著近年來大規模的集約化養殖，加強了動物之間疾病的傳播率和擴散率，因此也受到廣泛相關實驗室科學家的關注，并發明了PCR檢測診斷技術并為檢驗疫病提供了科學依據。這種技術操作簡單、容易掌握、有極高的靈敏度并且結果可靠，但該方法較強的擴增能力也帶來了一些令人頭疼的問題，也就是易污染，極其微量的污染可能造成假陽性的產生。

關鍵詞 動物疫病；PCR檢測；實驗室；污染

PCR檢測也就是聚合酶鏈式反應，是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術；它可看作是生物體外的特殊DNA的復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。這種技術被用在動物疫病的檢測當中能夠將動物的DNA片段無限放大，從而在動物疫病的防治過程中起到很好的效果，未來隨著時代的進步實驗室的環境會進一步得到改善。

1 引起 PCR污染的原因

1.1 PCR試劑的污染

引起PCR污染的主要原因之一是PCR試劑的污染，做實驗其基本的實驗器材就是試劑，保護好相關的試劑器材，也就是直接減少了在實驗中對污染物的接觸。具體表現在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

1.2 樣本間的交叉污染

引起PCR污染的主要原因之二是樣本間的交叉污染，在實驗的標本儲存的過程中，由于密封方法不當或是密封不夠嚴密導致樣本之間進行交互交叉感染，這是其中的原因之一，屬于人為存儲不當而導致的樣本感染。還有比較重要的原因是來自于客觀原因，或者也可以說是有人為所導致的，就是存儲的容器被污染，主要是樣本的容器外沾有標本而造成的相互交叉感染。又或者樣本核酸模板在人為提取的過程中，由于移液槍的污染而導致樣本間的污染等等因素，這些在人為的實驗過程中經常會出現，如果要避免的話建議做實驗的時候要留心，多注意細節以防樣本交叉污染帶來的實驗結果有誤。

1.3 PCR擴增產物污染

引起PCR污染的主要原因之三是PCR擴增產物污染，這是PCR反應中最主要最常見的污染問題，也是最主要的污染原因之一。因為PCR產物拷貝量是非常大的，其拷貝量遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染很可能造成假陽，就可形成假陽性，形成污染源，對實驗室環境帶來極強的破壞性。

1.4 操作者的污染

在實驗的過程中，由于操作者過于注重操作的結果和效益，往往在實驗的過程中就會因為心急造成誤操作，或者自身的頭發、皮膚等當中含有的細菌都會帶來PCR的污染。這不僅僅是個人的實驗室防護措施沒有做好，更重要的是實驗室的操作安全知識以及細節沒有從整體上有清晰的認識，長時間這樣開展實驗肯定是對實驗的不重視，其結果可想而知。

2 防止污染的措施

2.1 對PCR實驗室合理分區

防止污染的措施之一是對PCR實驗室合理進行分區，這是最重要的防止污染的措施之一，能從根本上杜絕PCR實驗室的污染。將實驗室分為以下三個區域：第一，標本處理區，包括擴增摸板的制備；第二，PCR擴增區，包括反應液的配制和PCR擴增；第三，產物分析區，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。在操作的過程中一定要將這些重要的工作區進行有效的隔離，操作的時候使用專業的器械，以防出現交叉感染。

2.2 良好的實驗室操作習慣

由于操作不當引起的實驗結果和樣本交叉污染的案例在科學實驗室當中經常可見，不良的操作習慣在實驗室搞科研是實在對科學不尊重的一種行為舉動，因此在進入實驗室操作之前一定要注意對自身進行全副的武裝。在開始操作的時候還要養成良好的操作習慣，該將本次實驗的器具放在哪里就放在哪里，不把器具混合交叉使用。

2.3 合理的試劑分裝與貯存

其次，相對來說比較有效的措施是要合理的試劑分裝與貯存，在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染導致實驗結果的失敗，因此將所有的試劑進行小量的包裝，而且將PCR反應液先行配置好再進行小量的分裝，放在零下負20攝氏度的環境下進行保存，避免感染次數的增加。

2.4 實驗設計盡量減少PCR循環次數

最后是要在實驗設計中盡量減少PCR循環次數，將PCR產物只要達到檢測水平就可以了，這樣就可以很好地避免高濃度大量的擴增產物帶來的污染。但是一旦產生了污染就必須要立即追蹤污染物，盡快找到污染的源頭，從而盡快保證實驗能夠順利開展。這個防治對策在經過多次的驗證后，多數實驗科學家都表示十分有效，能夠很好的減少PCR的污染。

3 結束語

綜上所述，在動物疫病PCR檢測實驗室的污染和對策當中格外要注意到的是要注意操作的規范性和嚴格性，目前引起 PCR污染的原因的主要原因都有 PCR試劑的污染、樣本間的交叉污染、PCR擴增產物污染和操作者的污染，因此在實驗的過程中一定要以嚴謹的科學的態度來對待每一場PCR檢測實驗，以防在實驗當中由于個人主觀上帶來的樣本交叉污染和實驗室器具的混合使用，這些對于實驗來說是毫無幫助的。所以在實驗污染防治當中要養成良好的操作習慣，改變不良的操作陋習。

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