綿羊Oct4基因的克隆及序列分析

田 麗，時邵輝，胡虹宇，陳勝男，李松美，王春生

（東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

Oct4是POU(Pit-Oct-Unc)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，由Pou5f1基因編碼[1,2]。它一般通過與保守序列的八個堿基“ATGCAAAT”結(jié)合，參與調(diào)控下游的基因。Oct4作為多能性基因是最早被發(fā)現(xiàn)的，主要在受精卵、桑椹胚(morula)、卵裂球、囊胚內(nèi)細胞團以及著床后胚胎的上胚層(epiblast)和原始生殖細胞(primordial germ cells,PGCs)等多能性細胞中表達[3]。例如在小鼠中，將Oct4基因敲除，該胚囊正常植入后不能形成多能性的內(nèi)細胞團，因此不能正常著床而停滯發(fā)育，在著床前期囊胚階段（胚胎發(fā)育3.5～4.5 d）死亡。表明Oct4基因在早期胚胎發(fā)育過程中形成多能性細胞是必要的[4]。同時研究表明，在體外培養(yǎng)的ES細胞中Oct4基因受到精確調(diào)控，只有當Oct4在一定范圍內(nèi)表達，細胞可保持未分化狀態(tài)。當Oct4表達量比兩倍正常水平還要高時，可導(dǎo)致ES細胞向原始內(nèi)胚層(primitive endoderm)和中胚層分化；當表達量低于正常水平50%時，ES細胞將會向滋養(yǎng)層（trophectoderm）和原始內(nèi)胚層分化[5]。但在去除外源性抑制因子的情況下，即使有Oct4基因，ES細胞也會呈現(xiàn)出分化狀態(tài)，這說明Oct4不是維持ES細胞亞全能分化特性的唯一條件，同時也證明了Oct4在ES細胞中的表達確實經(jīng)過精確調(diào)控，其表達水平?jīng)Q定了ES細胞的命運[6]。Oct4基因不僅在ES細胞培養(yǎng)中發(fā)揮重要作用，還是用于產(chǎn)生iPS細胞的大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子混合物中必需的中心重編程因子[7]。

目前，已經(jīng)克隆了人[8]、豬[9-11]、牛[12]和小鼠[13]等物種的Oct4基因，與其他動物相比，關(guān)于綿羊Oct4基因的相關(guān)報道很少。在本研究中，從體外發(fā)育的囊胚中擴增出綿羊Oct4基因編碼區(qū)序列，在此基礎(chǔ)上，預(yù)測了綿羊Oct4所表達的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并與其他物種進行了比較，為進一步研究綿羊Oct4基因的功能及利用綿羊源因子誘導(dǎo)綿羊體細胞重編程研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、載體和菌株

rTaq DNA聚合酶、T4連接酶、Oligo15引物、iPrep Trizol Plus RNA試劑盒（Invitrogen)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）、質(zhì)粒小提小量試劑盒（BioTeke）、膠回收試劑盒（Omega）；pMD18-T 載體；Trans5α 感受態(tài)細胞（TransGen Biotech）。

1.2 綿羊囊胚總RNA的提取

按iPrep Trizol Plus RNA試劑盒的說明書提綿羊囊胚總RNA，置于-80℃冰箱保存。

1.3 總cDNA的獲得

將上述總 RNA 1μg、Oligo15（50uM）1 μL加入 0.2 mL微量離心管中，用 RNase-free H2O 補齊至10 μL，70 ℃水浴 10 min，2 min 冰浴，然后依次添加 5×M-MLV Buffer 2 μL、dNTP（10mM）0.5 μL、RNase Inhibitor 0.25 μL、RTase M-MLV 5 μL 和 RNase-free H2O 0.75 μL，42 ℃水浴 1 h，70 ℃保溫 15 min，冰浴幾分鐘，獲得總cDNA，-20℃條件下保存，用于擴增綿羊Oct4基因。

1.4 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中牛Oct4基因的CDS部分，與綿羊基因組作對比，得到5個同源序列片段，連接片段，和牛Oct4基因的CDS同源性為97.78%，對應(yīng)氨基酸序列同源性為98.33%，推測該序列為綿羊Oct4基因的CDS區(qū)，設(shè)計該基因上下游引物，并分別引入適當?shù)拿盖形稽c。引物由大連TaKaRa公司合成，引物 相 關(guān) 信 息 如 下 ：Oct4-1 5’： GGGAATTATGGCGGGACACCTCGCTTC3’； Oct4-2 5’：GGGCTCGTCAGTTTGAATGCATAGGA 3’。

1.5 Oct4基因的擴增

基于上述實驗所得到的cDNA模板，Oct4-1和Oct4-2作為引物，PCR擴增Oct4基因。PCR反應(yīng)體系（總 25 μL）：cDNA 1μL，dNTP（2.5 mM）4μL，rTaq Buffer（10x）2.5 μL，上下游引物各 1 μL，rTaq 酶 0.3 μL。PCR 反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性 5min；94°C變性 30 S，58°C退火 45 S，72℃延伸90 s，共 30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7min。

膠回收PCR產(chǎn)物。室溫條件下，與pMD18-T simple載體連接10 min，用5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50 μL Trans5α型感受態(tài)細胞，涂平板，用Amp抗性及藍白斑一起進行篩選，挑取白色克隆菌株于含有Amp的LB培養(yǎng)基中，置于搖床中震蕩培養(yǎng)，擴大克隆菌株，質(zhì)粒小提小量試劑盒提取質(zhì)粒。

將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindII雙酶切，通過酶切鑒定連接正確的Oct4-pMD18重組質(zhì)粒，并送Invitrogen公司測序。

1.6 生物信息學分析

分別使用NCBI blastn程序和DNAMAN軟件比對核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列，并利用NCBI網(wǎng)站上的ORF finder分析軟件對開放閱讀框(ORF)進行識別。使用DNAMAN5.2軟件對高同源蛋白的氨基酸序列進行比對，構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹。使用PlantsP(http：//plantsp.genomics.purdue.edu/html/)和ScanProsite軟件(http：//us.expasy.org/prosite/)對蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域進行分析。使用Psort軟件(http：//psort.ims.u-tokyo.ac.jp/)定位Oct4蛋白的亞細胞。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴增綿羊Oct4基因

Oct4-1和Oct4-2作為擴增引物，RT-PCR擴增獲得的模板cDNA，1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，紫外燈照射下可見凝膠上呈現(xiàn)出約1 100 bp的目的條帶（圖1-3）。

圖1 Oct4基因PCR擴增

圖2 pMD18-T simple-Oct4質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

圖3 pMD18-T simple-Oct4質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.2 綿羊Oct4編碼區(qū)核苷酸序列及氨基酸序列分析

生物軟件分析測序正確的Oct4-pMD18重組質(zhì)粒，分析表明綿羊Oct4基因編碼區(qū)序列長度為1 083 bp包括終止密碼子在內(nèi)，可以編碼360個氨基酸。綿羊Oct4基因CDS區(qū)的核苷酸序列相比與牛、貓、人、恒河猴、小鼠、兔、大鼠和豬等物種，相應(yīng)序列的同源性分別為97.8%、91.1%、89.1%、89.0%、82.3%、85.7%、83.2和94.7（圖 4），其氨基酸序列同源性分別為 98.3%、93.1%、91.4%、91.1%、83.8%、85.7%和 97.2（圖 5）。

圖4 綿羊Oct4基因CDS序列與其他物種同源性分析

圖5 綿羊Oct4蛋白氨基酸序列與其他物種同源性分析

利用DNAMAN軟件獲得了九種動物Oct4基因氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明，與綿羊親緣關(guān)系最接近的是牛，具有很小的遺傳距離；與豬、貓、兔、人、恒河猴、小鼠及大鼠親緣關(guān)系依次變遠，基本上與傳統(tǒng)分類學保持一致（圖6）。

圖6 九個物種Oct4基因編碼區(qū)核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

2.3 分析綿羊Oct4蛋白三維結(jié)構(gòu)

利用在線軟件（http：//prosite.expasy.org/）對綿羊Oct4基因進行分析，分析表明在156-168位氨基酸（KRItLGYtQaDVG）和180-193位氨基酸（SQTTICRFEaLqLS）含有兩個 POU結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)構(gòu)（如圖7），在263-286位氨基酸含有1個HOMEOBOX-1結(jié)構(gòu)域（IAqqLgLEkdVVRVWFcNrrqkgK）。

圖7 綿羊Oct4蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論與討論

Oct-4是動物種系之間具有高度保守性的POU轉(zhuǎn)錄因子，也是迄今發(fā)現(xiàn)最早也是最重要的維持胚胎干細胞多潛能性和促進自我更新的關(guān)鍵因子[14,15]。它的表達水平不僅決定了ES細胞的命運，影響其分化狀態(tài)，還在誘導(dǎo)小鼠成纖維細胞成為多功能干細胞過程中發(fā)揮重要作用[16-18]。豬和牛等家畜的Oct4基因已經(jīng)被克隆，分子特性也已被闡明[9-12,19]。但迄今為止，尚未見到有關(guān)綿羊Oct4基因的相關(guān)報道。由于Oct4基因具有強組織表達特異性，僅表達與胚胎干細胞和原始生殖細胞等具有多潛能性的細胞中，隨細胞的分化表達量下降，體細胞中未見表達，所以O(shè)ct4基因的克隆十分困難。Bao L等[20]也曾嘗試利用小鼠的這四個因子誘導(dǎo)綿羊體細胞重編程，結(jié)果表明誘導(dǎo)效率較低，被誘導(dǎo)的細胞不能啟動內(nèi)源多能性基因的表達。研究組推測各因子氨基酸同源性的不同導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)更大的差異是造成異源因子誘導(dǎo)效率低的重要原因之一。因此，為克隆獲得綿羊的Oct4基因序列，本研究利用牛Oct4基因的CDS序列與GenBank的綿羊基因組比對，發(fā)現(xiàn)5個同源結(jié)構(gòu)域，推測為綿羊Oct4基因的5個外顯子，并將該5個外顯子拼接，序列包含1083個堿基，為3的整數(shù)倍，且包含終止密碼子“TGA”。針對該序列設(shè)計引物，從綿羊囊胚的cDNA中擴增獲得一段基因序列（見圖1-3），該序列與牛CDS的同源性高達97.8%，與其他物種Oct4基因具有82.3%以上的同源性，具有較高的同源性（見圖4）。與此同時，推測的氨基酸序列與牛的同源性高達98.3%（見圖5）。對本研究中獲得的Oct4基因的編碼序列分析顯示，Oct4定位于細胞核中（圖7）并含有符合Pou box氨基酸的統(tǒng)一序列。這些結(jié)果說明，Oct4調(diào)控綿羊細胞分化過程的機制可能與其他動物相同。

綜上所述，本研究通過整理和合成成功獲得了綿羊的Oct4基因，但該基因是否可用于提高綿羊iPS的誘導(dǎo)效率需要進一步研究驗證。