基于1H-NMR的原發性肝癌脾虛濕盛證患者尿液代謝組學研究

王 東 李晶潔

代謝組學(metabonomics) 是研究生物體代謝活動中產生不同的內源性代謝物質，以探究機體整體性代謝變化情況及代謝途徑的一門新興學科。代謝組學的出現為生命科學的發展提供了有力的現代化實驗技術手段，通過質譜、色譜、核磁共振等化學分析技術，分析不同時期或不同狀態下內源性代謝產物的比例、濃度及代謝通量等變化，以找到與疾病診斷相關的標志性代謝物[1]。近年來代謝組學用于中醫證型的研究取得了一定的進展，為中醫病因病機、中醫證型等許多方面提供微觀指標的量化[2]，使中醫辨證客觀化目標的實現成為可能。同時，代謝組學技術不失為探尋腫瘤中醫證候物質基礎的較適宜的手段，本研究通過采用核磁共振氫譜檢測，用代謝組學方法來探討新疆原發性肝癌脾虛濕盛證患者的病機及特異性代謝標志物，以闡述脾虛濕盛證及非脾虛濕盛證肝癌患者體內主要代謝特征及其差異，探討肝癌脾虛濕盛證的客觀物質基礎。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取新疆醫科大學附屬中醫醫院住院治療的35例脾虛濕盛證肝癌患者作為脾虛濕盛證組，35例非脾虛濕盛證肝癌患者作為非脾虛濕盛證組，以上患者符合原發性肝癌西醫診斷標準，且以原發性肝癌為第一診斷，及新疆醫科大學附屬中醫醫院體檢中心體檢的40例和平質健康體檢者作為對照組，其中肝癌患者符合以下診斷標準及納入標準，脾虛濕盛證患者符合以下中醫證型診斷依據。三組樣本基礎信息見表1。

表1 三組樣本基礎信息

1.2 診斷標準

原發性肝癌診斷采用第八屆全國肝癌學術會議上通過的《原發性肝癌的臨床診斷與分期標準》[3]，所有患者均經組織學檢查證實為原發性肝癌者；中醫脾虛濕盛證診斷參照國家中醫藥管理局發布的《中醫證候辨治規范》及《中醫病證診斷療效標準》[4]。

1.3 納入標準及排除標準

①年齡>18歲；②所有納入對象均自愿參與研究并簽署知情同意書；③排除有精神障礙或嚴重心腦血管疾病者；④排除合并有活動性結核或嚴重感染性疾病患者;⑤排除妊娠期或哺乳期婦女。

1.4 檢測方法

標本收集與處理：于患者入院后第二天清晨空腹采集中段尿液，并于4 ℃，3 500 r/min離心10 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存備用。待全部尿液收集完成后，將樣品從低溫冰箱中取出并在室溫中解凍，取400 μl尿液置離心管中，加入200 μl磷酸緩沖液(0.2 mol/l Na2HPO4～0.2 mol/l NaH2PO4，pH 7.4，用重水配制)，靜置20 min后4 ℃,3 500 r/min離心10 min，取上清液500 μl移入5 mm核磁管中，進行核磁共振氫譜檢測(proton nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR)。

1H-NMR檢測：首先對尿樣采用有預飽和的1D NOESY脈沖序列，把參數設置如下：譜寬8000 Hz、混合時間0.15 s、馳豫延遲時間2 s、采樣點數64 k，累加次數64次；在混合時間及馳豫延遲時間里采用預飽和方式以抑制水峰，偏置頻率設置在水峰的位置。FID信號通過處理后經傅立葉變換轉化為NMR圖譜，所得NMR數據進行相位調整和基線校正后，對δ0.4～9.4范圍內的譜圖按每段δ0.01的寬度進行分段積分，積分后的數據按每張譜的總積分強度歸一化，所得數據輸出并轉換到Excel文件保存。將Excel格式數據輸入到SIMCA-P 10.0軟件(瑞典，Umetrics,Umea)進行多元統計分析。

1.5 統計學分析

1H-NMR圖譜進行基線校正和相位校正后檢測，數據采用平均中心化(mean centering)或Pareto標度化(paretoscaling)進行預處理，再綜合采用多變量統計學方法中主成分分析(principal component analysis，PCA) 、偏最小二乘判別分析(partial least square discriminant analysis，PLS-DA) 及單變量統計分析方法測定相關代謝標志物的含量。對各組患者尿液NMR譜圖中檢測到的代謝產物的峰面積進行雙尾Welch's t test分析，以P<0.05為兩組差異具有統計學意義。以下結果中數值為代謝產物色譜峰的相對強度，將譜圖按0.0lppm分段積分后，以每張譜總積分值為10000進行歸一化，同一譜峰積分合并后計算其所對應代謝產物的(mean±SD)。

2 結果

原發性肝癌患者尿中與機體能量代謝密切相關的肌酐含量顯著較對照組健康人低(P<0.01)，且脾虛濕盛證組低于非脾虛濕盛證組(P<0.05)；而牛磺酸的含量顯著高于對照組,且脾虛濕盛證組高于非脾虛濕盛證組(P<0.05)。與對照組相比肝癌患者尿中的馬尿酸、氧化三甲胺(TMAO)含量下降，且脾虛濕盛證組明顯低于非脾虛濕盛證組(P<0.05)。三梭酸循環的中間產物--檸檬酸，在肝癌患者尿中含量也明顯低于對照組，而琥珀酸高于對照組，兩者在脾虛濕盛證組與非脾虛濕盛證組比較，差異具有統計學意義。原發性肝癌患者尿中乙酸含量顯著性高于對照組(P<0.05)，而在脾虛濕盛證組與非脾虛濕盛證組中比較，無統計學差異。肝癌患者尿中丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸含量均較對照組低，且脾虛濕盛證組低于非脾虛濕盛證組(P<0.05)。 需要指出的是，以下數值為代謝產物色譜峰的相對強度，各組尿中代謝物含量變化具體見表2。

表2 各組尿樣代謝物水平變化情況

注：與對照組比較，#為P<0.05；與非脾虛濕盛證組比較，*為P<0.05。

3 討論

我們在臨床上對新疆大量肝癌患者的臨床診治中，發現肝癌的主要病機是脾胃受損，釀生內濕，導致肝癌的正虛主要是脾虛，實邪主要是濕邪，這可能跟新疆地區人們的生活習慣有關[5]，新疆人恣飲烈酒，喜食膏粱厚味，口味重而多咸，這種飲食習俗容易損傷脾胃，釀生濕痰。明代《景岳全書》說：“酷飲無度，傷于酒濕，或以縱食生冷，敗其真陽”脾胃損傷濕邪易侵，導致脾胃運化失職，脾虛容易駐濕，駐濕又會加重脾虛[6]，出現不停的惡性循環。其中脾虛是濕盛的原因，又是濕盛的結果，濕邪阻滯臟腑經絡，易變生為癥瘕、瘀阻、積聚[7]。臨床流行病學調查研究也表明：肝癌早、中、晚期不同階段，常見有脾虛濕盛證患者。潘敏求等[8]采用頻數和排序等統計分析253篇中醫藥治療原發性肝癌的文獻，結果表明脾虛濕困出現頻率為79.07%，是中醫臨床辨證最常見的證型之一。凌昌全教授小組研究發現[9]，臨床肝癌Ⅱ、Ⅲ期肝膽濕熱、脾虛濕阻證候出現率較高，健脾化濕排毒是常用治療大法。這些研究均說明脾虛濕盛是肝癌的主要病機,并貫穿于疾病的始終。本研究就選用新疆地區的原發性肝癌脾虛濕盛證患者作為研究對象，通過對患者尿液代謝組學研究，以探討新疆原發性肝癌脾虛濕盛證患者的病機及特異性代謝標志物，以探尋腫瘤中醫證候物質基礎及使中醫辨證客觀化目標的實現成為可能。

代謝組學是1999 年由英國Nicholson教授及其同事提出的[10-11]，是繼基因組學、轉錄組學及蛋白質組學之后近年來發展起來的一門新興學科，通過對各種常見生物體內生物體液和組織代謝物進行檢定和分析，把機體的代謝信息與病理生理過程相關聯起來，以揭示機體的代謝本質及研究機體整體與全局[12]。目前代謝組學發展趨勢用于輔助疾病的診斷與分型，如對冠心病診斷、腫瘤機制、藥物的肝毒等方面的研究[13]。羅氏等[14]研究，對肝郁脾虛模型大鼠的血漿進行超導傅立葉變化核磁共振波譜儀檢測，分析其代謝物的共性及生物標記物的主成分，結果發現肝郁脾虛證組大鼠的血漿乳酸、醋酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和部分未知化合物的譜峰峰形改變較其他組明顯，且隨著時間的不同，代謝物譜峰也有差異，提示通過代謝組學可找到與中醫證型相關聯的生物學基礎。Li等[15]通過MNR 技術對氣虛血瘀證模型鼠的尿液代謝物進行分析，發現模型組的甲酸鹽、肌酐等產物與正常組相比存有差異。動物實驗亦證實不同證型大鼠血漿代謝譜之間存在差異[16]。

本研究對比了原發性肝癌患者與健康人，原發性肝癌脾虛濕盛證患者與非脾虛濕盛證患者的肌酐、牛磺酸、檸檬酸、馬尿酸、琥珀酸、氧化三甲胺(TMAO)、乙酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸等含量。其中肌酐與機體能量代謝密切相關，在原發性肝癌患者尿中肌酐含量顯著較對照組健康人低(P<0.01)，且脾虛濕盛證組低于非脾虛濕盛證組(P<0.05)，脾虛濕盛證患者尿液肌酐含量的減少也提示了其整體代謝水平低下。牛磺酸是膽汁酸鹽的重要組成部分，主要參與脂肪的消化過程，牛磺酸水平的紊亂可能與機體脂質代謝失調有關，有研究稱牛磺酸可做為肝硬化相關的代謝標記物之一[17]，在本研究中原發性肝癌患者的牛磺酸水平顯著高于對照組,且脾虛濕盛證組高于非脾虛濕盛證組(P<0.05)，其提示脂類代謝水平紊亂。馬尿酸是腸道菌群產生的腐敗產物，而氧化三甲胺也與腸道菌群代謝有關[18]。正常情況下，腸道菌群可刺激宿主免疫功能，幫助宿主防御疾病，協助宿主消化吸收,當腸道菌群失調時，人就會出現腹瀉、便秘、消化不良等癥狀，而馬尿酸、氧化三甲胺含量的異常可反映患者腸道微生物菌群的失調[19]。本研究中，肝癌患者尿中的馬尿酸、氧化三甲胺(TMAO)含量比對照組下降，且脾虛濕盛證組明顯低于非脾虛濕盛證組(P<0.05)。這與該證型臨床多表現為便溏、腹瀉的證候相一致。同時檸檬酸、琥珀酸作為三梭酸循環的中間產物，對于機體物質代謝產生重要作用,三梭酸循環是糖類、脂類、氨基酸的最終代謝通路，是機體獲得能量的主要方式，肝癌患者尿中檸檬酸含量明顯低于健康人群，而琥珀酸高于健康人群，兩者在脾虛濕盛證組與非脾虛濕盛證組比較，差異也具有統計學意義，由此可見，脾虛濕盛證肝癌患者出現糖代謝紊亂。另外，丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸在生物體內的蛋白質代謝過程中占重要地位，參與生物中的許多重要化學反應[20]，而肝臟是體內氨基酸代謝的主要場所，當肝臟由于各種原因損傷時，可導致體內發生復雜的代謝紊亂，肝細胞內氨基酸代謝降低[21]。本研究中原發性肝癌患者尿中丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸含量均較對照組低，且脾虛濕盛證組患者較非脾虛濕盛證低，提示肝癌患者尤其是脾虛濕盛證肝癌患者氨基酸分解代謝水平低下，蛋白合成不足。同時谷氨酸代謝異常易導致出現中樞疲勞，而脾虛濕盛證患者的尿液中谷氨酸含量降低，與該證型患者出現神疲懶言、體倦乏力的臨床表現相一致。綜上所述，對脾虛濕盛證肝癌患者尿液代謝組學研究發現，原發性肝癌患者存在糖代謝、脂類代謝、氨基酸分解代謝紊亂，且原發性肝癌脾虛濕盛證患者體內多種生命代謝的紊亂程度較非脾虛濕盛證患者嚴重。