藥對知母-黃柏對胰島素抵抗的改善作用

金惠杰，邱昆成，李嘉華，林愛華，劉奕明

(廣州中醫藥大學第二附屬醫院中藥藥代動力學實驗室，廣東省中醫證候臨床研究重點實驗室，廣東 廣州 510120)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的生理病理基礎，主要表現為胰島素敏感性降低，不能促進外周靶組織(肝臟、脂肪組織、骨骼肌)的葡萄糖攝取和利用[1]。IR被認為是引發T2DM的始動因素[2]，改善IR對T2DM的治療及防治并發癥具有重要意義。

T2DM屬于中醫學“消渴”范疇，病機特點為陰虛為本、燥熱為標。知母-黃柏藥對(Zhimu-Huangbaiherbpair，ZB)出自《蘭室秘藏》，又名療本滋腎丸，二者相須為用，主治陰虛燥熱、骨蒸盜汗，是典型的治療消渴的藥對[3]。現代藥理研究表明，知母-黃柏藥對中的芒果苷、知母皂苷、小檗堿等有效成分對IR均具有改善作用[4-6]，而其作為治療消渴的典型藥對，對IR的影響目前尚不清楚。因此，本研究建立T2DM大鼠模型及HepG2細胞IR模型，從糖脂代謝方面探討藥對知母-黃柏對IR的藥效作用。

1 材料

1.1 藥物與試劑鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，純度>98%，Sigma公司，批號: 111607-200301，用前用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解；無脂肪酸牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，購于北京索萊寶公司；棕櫚酸鈉、油酸鈉，均購自Sigma公司，加超純水于75 ℃水浴溶解完全后，與無脂肪酸BSA溶液混勻并過濾除菌，用前采用培養液稀釋成含3% BSA、1 mmol·L-1棕櫚酸(palmitic acid，PA)和2 mmol·L-1油酸(oleic acid，OA)的高脂添加劑；DMEM高糖培養基、南美胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液，均購自美國Gibco公司；胰島素ELISA試劑盒，購于上海酶聯生物科技有限公司；葡萄糖氧化酶法檢測試劑盒，購自南京建成；甘油三脂(triglyceride，TG)檢測試劑盒，購自北京普利萊；鹽酸二甲雙胍，購自中美上海施貴寶制藥有限公司。

黃柏(批號: 141112771，產地四川)、知母(批號: 140806121，產地河北)飲片，均購自廣東康美藥業股份有限公司，用前粉碎至適當細度并過篩，知母黃柏按1 ∶1比例充分混合(低劑量組20 g ∶20 g，高劑量組60 g ∶60 g)，之后置于圓底燒瓶，加純水至250 mL，浸泡0.5 h后，回流裝置煎煮1 h，過濾，加入純水250 mL繼續煎煮1 h，過濾，合并濾液，濃縮并定容至200 mL，于4 ℃冰箱保存，用于動物灌胃給藥。以上濃縮液取部分，置于-80 ℃冰箱預凍后，放入已事先降至預定溫度的冷凍干燥機中，干燥24 h，得到知母-黃柏藥對凍干粉，4 ℃冰箱保存，用于細胞給藥，用前采用培養液溶解并濾菌。

1.2 實驗動物與細胞SPF級♂SD大鼠，體質量(180±10)g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，合格證號：(粵)44007200026586。動物飼養于廣東省中醫院實驗動物中心，飼養溫度(20±2.0)℃，相對濕度40%～60%,照明晝夜明暗交替周期為12 h，所有大鼠自由攝食、飲水。高脂高糖飼料：蔗糖20%、豬油10%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、酪蛋白10%、磷酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、預混料0.4%、基礎飼料57.2%，由廣東省實驗動物中心提供。HepG2細胞株，來源于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.3 儀器AB135-S電子天平(Mettler Toledo公司)；Orion Star A211臺式pH測量儀(美國賽默飛世爾科技公司)；Synergy H1型多功能酶標儀(美國佰騰儀器有限公司)；LDZ5-2臺式離心機(北京醫用離心機廠)。

2 方法

2.1 動物模型的建立SD大鼠30只，適應性喂養3 d。隨機抽取6只大鼠作為正常組(Control)，普通飼料喂養，其余24只大鼠采用高脂高糖飼料喂養。4周后，正常組大鼠按照10 mL·kg-1注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，其余24只大鼠按照35 mg·kg-1劑量腹腔注射STZ。造模前禁食不禁水12 h，注射STZ后d 7檢測空腹血糖(fasting blood glucose, FBG), FBG>16.7 mmol·L-1為造模成功的標準。

2.2 動物模型的分組及給藥24只大鼠造模成功后，隨機分為模型組(Model)、二甲雙胍組(Metformin)、知柏高劑量(ZB 4.5 g·kg-1)和低劑量(ZB 1.5 g·kg-1)組，每組6只。二甲雙胍組按0.25 g·kg-1灌胃給予鹽酸二甲雙胍混懸液，知柏高、低劑量組分別按照生藥4.5、1.5 g·kg-1灌胃給予知母-黃柏水煎液；模型組與正常組按照10 mL·kg-1灌胃生理鹽水。各組大鼠每天灌胃1次，連續給藥4周。

2.3 各組動物體質量、FBG、胰島素、TG的檢測測定各組大鼠造模前(STZ注射前)與給藥前(STZ注射d 7)的空腹體質量與空腹血糖。給藥4周后，各組大鼠禁食不禁水12 h，再測1次空腹體質量，乙醚麻醉后眼眶采血0.5 mL，3 000 r·min-1離心10 min，取血漿備用，用于檢測FBG、血清胰島素(fasting insulin，FINS)水平及TG含量。FBG及FINS分別采用葡萄糖測定試劑盒和胰島素ELISA試劑盒測定。葡萄糖試劑盒為氧化酶法，胰島素試劑盒為雙抗夾心法，并按以下公式計算胰島素敏感指數(insulin sensitivity index， ISI)和胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment-insulin resistance index，Homa-IR)：ISI=ln[1/(FBG×FINS)]，Homa-IR=FBG×FINS/22.5。TG由廣東省實驗動物檢測所采用日立7020全自動生化分析儀檢測。

2.4 HepG2細胞IR模型的建立、分組及給藥HepG2細胞株用含10% FBS、1%青/鏈霉素的高糖DMEM，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，取對數生長期的HepG2細胞，以6 000個細胞每孔接種至96孔板，每孔200 μL，分為正常組(Control)、模型組(Model)、二甲雙胍組(Metformin，5 mmol·L-1)、知柏高、中、低劑量組(ZB生藥384、192、96 mg·L-1)，每組設3個復孔。待細胞長至80%左右，正常組加入含3% BSA的培養液，其他各組加入含3% BSA、1 mmol·L-1PA和2 mmol·L-1OA的培養液分別誘導24 h，構建IR模型，成功制備IR模型后給藥24 h。

2.5 HepG2細胞葡萄糖消耗量測定將HepG2細胞株接種至96孔培養板培養，培養方式及實驗分組同“2.4”，并設置空白對照孔。給藥24 h后，取上清，用葡萄糖氧化酶法檢測各實驗組培養液中的葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量：葡萄糖消耗量=空白孔葡萄糖含量-測定孔葡萄糖含量。考慮細胞增殖可能對葡萄糖消耗造成影響，各孔取上清后，再利用MTT法測定孔底細胞活力，用于校正葡萄糖消耗量(葡萄糖消耗量/細胞活力)。

2.6 HepG2細胞內TG含量測定將HepG2細胞以每孔1.2×105個接種至6孔培養板培養，培養方式及實驗分組同“2.4”。給藥24 h后，棄各孔培養液，加細胞裂解液萃取細胞內的TG，收集的細胞裂解液70 ℃加熱10 min后，2 000 r·min-1離心5 min，取上清，利用TG檢測試劑盒測定TG含量，并用BCA試劑盒測定其蛋白濃度，用于校正TG含量。

3 結果

3.1 知母-黃柏對糖尿病大鼠體質量的影響STZ注射前各組大鼠體質量無明顯差異，注射7 d后，模型組、二甲雙胍組、知柏高、低劑量組體質量均明顯低于正常組(P<0.05)，大鼠出現多飲多食多尿消瘦，即“三多一少”癥狀，符合糖尿病的臨床特征。給藥4周后，正常組大鼠體質量持續增長，其他各組體質量持續減輕，且明顯低于正常組(P<0.01)，模型組與各給藥組之間無明顯差異(Tab 1)。

Tab 1 Changes of rat weight in each

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.2 知母-黃柏對糖尿病大鼠空腹血糖的影響STZ注射前，各組大鼠FBG值均差異無顯著性。STZ注射d 7，模型組、二甲雙胍組、知柏高、低劑量組FBG明顯高于正常組(P<0.01)，4組之間FBG差異無顯著性。給藥4周后，與模型組相比，二甲雙胍組、知柏高、低劑量組FBG均明顯降低(P<0.05)，各給藥組之間無明顯差異(Tab 2)。

Tab 2 Changes of rat FBG in each

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

3.3 知母-黃柏對糖尿病大鼠空腹胰島素的影響給藥前各組大鼠FINS含量差異均無顯著性。給藥4周后，與正常組相比，模型組FINS升高，ISI明顯下降(P<0.01)，Homa-IR明顯上升(P<0.01)，表明糖尿病模型大鼠體內胰島素敏感性降低，胰島素抵抗指數升高，出現明顯的胰島素抵抗特征。與模型組相比，二甲雙胍組、知柏高、低劑量組ISI明顯升高(P<0.05)，Homa-IR明顯降低(P<0.01)；知柏高、低劑量組亦能明顯降低FINS含量(P<0.05)，二甲雙胍組FINS含量亦有下降，但無統計學差異(Tab 3)。

3.4 知母-黃柏對糖尿病大鼠TG的影響STZ注射d 7，模型組、二甲雙胍組、知柏高、低劑量組TG含量明顯高于正常組(P<0.05)，4組之間TG含量差異無顯著性。給藥4周后，模型組TG含量持續升高，明顯高于正常組(P<0.01)；與模型組相比，各給藥組TG含量明顯降低(P<0.05)，各給藥組之間無明顯差異(Tab 4)。

3.5 知母-黃柏對HepG2胰島素抵抗細胞葡萄糖消耗量的影響與正常組相比，模型組糖耗量明顯下降(P<0.01)；給予二甲雙胍或知柏高、中、低劑量后，細胞葡萄糖消耗量明顯升高(P<0.05)，各給藥組與模型組之間細胞活性差異無顯著性(Tab 5)。

3.6 知母-黃柏對HepG2胰島素抵抗細胞TG含量的影響HepG2胰島素抵抗細胞的TG含量與正常組相比明顯升高(P<0.01)；二甲雙胍、知柏高、中劑量組TG含量相比模型組明顯下降(P<0.05)，知柏低劑量組亦有下降，但差異無統計學意義(Fig 1)。

Fig 1 Effect of ZB on 24 h TG content in HepG2 cell

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

4 討論

T2DM是威脅人類健康的重要代謝性疾病，其患病率呈逐漸增長的趨勢，而IR作為T2DM的重要特征，存在于整個疾病的發生發展過程，是研究T2DM發病機制的首選對象[7]。張蕾等[8]研究表明，高脂高糖飲食可以引起肝細胞內TG過度堆積為主要病理特征的脂肪肝IR大鼠模型。本實驗利用STZ聯合高脂高糖飼料喂養的方法建立糖尿病大鼠模型，結果顯示，模型組大鼠出現多飲、多食、多尿、體質量減輕的臨床“三多一少”癥狀，并且出現高血脂、高血糖、高Homa-IR及低ISI的生化指標特征，符合T2DM基本特征IR的臨床特點，提示造模成功。

肝臟是調節機體能量平衡，尤其是糖、脂代謝的主要器官，因此，肝臟的IR在機體IR中占有重要地位。HepG2細胞源于人的肝胚胎瘤細胞株，在高水平的胰島素條件下，其表面胰島素受體的數目下降程度與胰島素水平及刺激持續的時間呈正相關[9]，因此HepG2細胞是體外研究IR發病機制和降糖藥物作用機制的理想細胞模型。高濃度游離脂肪酸可以導致肝臟脂肪沉積，促使糖脂代謝異常,從而引發IR[10]。本實驗采用含1 mmol·L-1棕櫚酸和2 mmol·L-1油酸的培養液，體外培養誘導HepG2細胞24 h，建立肝臟IR細胞模型。結果表明，細胞的葡萄糖消耗能力下降，胞內TG含量升高，符合肝臟細胞IR的代謝特征，表明模型建立成功。

Tab 3 Changes of rat FINS in each n=6)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsmodel

Tab 4 Changes of rat TG in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

Tab 5 Effect of ZB on 24 h glucose consumption in HepG2 cell model with insulin

**P<0.01vscontrol;##P<0.01,#P<0.05vsmodel

本實驗結果顯示，藥對知母-黃柏對糖尿病大鼠及HepG2胰島素抵抗細胞均有明顯的降糖、降脂作用，有效改善糖脂代謝紊亂癥狀。動物實驗中，相比給藥前、給藥4周后模型組的FBG及TG含量持續升高，而各給藥組FBG及TG含量無明顯改變,說明藥對知母-黃柏對糖尿病大鼠FBG及TG含量的進一步升高有抑制作用，且作用強度與二甲雙胍相近。另外，二甲雙胍及知柏低劑量對糖尿病大鼠體質量的降低有一定的緩和作用，而知柏高劑量組大鼠體質量相對模型組有所降低，可能是因為知母和黃柏均為寒涼藥物，長期高劑量給藥導致大鼠脾虛，從而體質量減輕的癥狀并無明顯改善。細胞實驗研究表明，知柏高、中劑量均能明顯增加HepG2胰島素抵抗細胞的葡萄糖消耗量，并同時降低TG含量，且中劑量作用強度稍強于二甲雙胍。另外，各給藥組細胞活力與模型組細胞活性基本一致，表明知母-黃柏的降糖作用不依賴于細胞的增殖。

二甲雙胍作為T2DM的首選藥物，其降糖機制主要是通過抑制肝臟糖異生，增加周圍組織對胰島素的敏感性，從而使血糖水平降低[11]。本文研究表明，藥對知母-黃柏高、低劑量均能明顯降低糖尿病大鼠胰島素抵抗指數及血漿胰島素水平，提升胰島素敏感指數，對IR具有一定的改善作用，且效果與二甲雙胍相當。此結果提示，降低胰島素抵抗指數，提升胰島素敏感性是藥對知母-黃柏改善IR糖脂代謝紊亂的作用機制之一。

本文從動物及細胞水平證實了藥對知母-黃柏對IR具有明顯的改善作用，表明其作用是通過降低胰島素水平，提升胰島素敏感性，促進糖脂代謝來實現的，為臨床指導用藥提供了重要依據。