龜鹿二仙膠對創傷后應激障礙大鼠行為學和HPA軸功能的影響

葉偉瓊，陳 潔，黃云玲，牛 婕，祝鵬輝，吳麗麗，嚴 燦

(廣州中醫藥大學中西醫結合基礎研究中心，廣東 廣州 510006)

創傷后應激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)是個體經歷了威脅生命的重大創傷事件之后，延遲出現的身心疾病。其核心癥狀包括創傷經歷的病理性重現、警覺性增高和持續性回避，此外，還會有恐懼、焦慮和抑郁等常見臨床表現。PTSD在當今社會中發病率不斷提高，并且難以治愈，終身患病率高[1]，引起了社會各界的關注。目前，治療PTSD的臨床一線藥物都是以抗抑郁藥為主，包括5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)和選擇性5-羥色胺與去甲腎上腺素再攝取抑制劑(serotonin and norepinephrine reuptake inhibitors，SNRIs)，如帕羅西汀(paroxetine，PRX)、文拉法辛等。但是這些抗抑郁的藥物并不能完全治愈PTSD，有些癥狀仍長期存在。此外，長期服用此類藥物還會出現明顯的副作用。因此，尋找和發現安全有效的抗PTSD新藥非常必要。

單一延長應激(single prolonged stress，SPS)是目前研究PTSD最常采用的動物造模方法之一，SPS很好地模擬了PTSD患者的臨床表現，如焦慮抑郁、易激惹、高喚醒、學習記憶能力下降等[2]。皮質酮(corticosterone，CORT)是評價下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸功能的一個重要指標。但是，對PTSD而言，不管是臨床還是對嚙齒類動物的研究，有關外周血中CORT水平的報道卻不盡相同，或升高或下降或不變[3]。由于PTSD是遲發性的精神心理疾病，因此，不同時間點的檢測可能會對CORT的結果造成重要影響。盡管有關CORT的報道不一致，但HPA軸負反饋增強是有關PTSD的較為公認的病理基礎[4]，因此，調節HPA軸功能紊亂對于PTSD治療具有重要的意義。龜鹿二仙膠(Guiluerxianjiao，GLEXJ)由鹿角膠、龜板、枸杞子、人參組成，具有補腎填精的功效。研究發現，GLEXJ能提高自然衰老小鼠的抗氧化能力和學習記憶能力，明顯改善一氧化碳中毒遲發性腦病患者的癥狀體征，顯示出其在神經系統疾病治療中的良好效果[5]。本研究采用SPS方法建立PTSD大鼠模型，在不同時間點動態觀察PTSD大鼠HPA軸功能和行為學的變化，以及GLEXJ的影響，以期揭示GLEXJ治療PTSD的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及飼養環境SPF級成年SD大鼠282只，體質量(180～220) g，由南方醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)-2016-0041。大鼠每籠5只，隨機分成正常組(control)、模型組(SPS)、龜鹿二仙膠組(GLEXJ)和帕羅西汀組(PRX)。整個實驗過程中大鼠自由飲食，飼養在室溫(23±2)℃，濕度(55±5)%，12 h光照/黑暗周期的環境中。所有的動物實驗均符合廣州中醫藥大學動物實驗倫理委員會的要求。

1.2 藥物的制備與給藥方法鹿角膠、龜板、枸杞子、黨參，均購于廣州至信藥業股份有限公司，按3 ∶2 ∶2 ∶1的比例，水煎濃縮至所需濃度，給藥劑量為3.6 g·kg-1。PRX購于浙江華海藥業股份有限公司(規格：每片20 mg，批號：H20031106)，用蒸餾水配制成2 g·L-1的溶液待用，給藥劑量為10 mg·kg-1。自造模后d 8起，每日8 ∶30～10 ∶30對GLEXJ和PRX組大鼠分別灌胃給藥，連續14 d或21 d；對正常組和模型組大鼠則給予純水灌服。地塞米松磷酸鈉注射液，購于遂成藥業股份有限公司(規格：5 mg·mL-1，批號：H41021255)。體積分數為0.05的葡萄糖注射液，購于廣東科倫藥業有限公司(規格：50 mg·mL-1，批號：H51020636)。地塞米松磷酸鈉注射液用體積分數為0.05葡萄糖注射液配制成濃度為1.5 g·L-1的溶液待用。

1.3 試劑與儀器CORT ELISA試劑盒(批號：ab108821)，購于英國Abcam公司；促腎上腺皮質激素(adrenocorticotrophic hormone，ACTH) ELISA試劑盒(批號：ESB-EO6875r)，購于武漢華美生物工程有限公司；水合氯醛(批號：Q/12DJ0149-2014)，購于天津市大茂化學試劑廠；乙醚(批號：20180102-1)，購于廣州化學試劑廠。YZB/USA3903-2010多功能酶標儀(Bio-Rad公司)；GB/T23111電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；YHC-11001A體重秤(瑞安市英衡電器有限公司)；曠場實驗設備(TM-ZFT)、高架十字迷宮實驗設備(TM-GJT)及視頻分析系統，均由廣州飛迪生物科技公司提供。

1.4 PTSD大鼠模型的制備采用目前公認，也是文獻報道最多的SPS方法制備PTSD大鼠模型[4]。SPS造模方法：經過7 d適應性喂養后，除正常組外，所有的大鼠均先束縛2 h，再強迫游泳20 min，休息15 min，最后乙醚麻醉至意識喪失后，放回原籠繼續無打擾靜養7 d。束縛器為直徑6 cm、深20 cm的可活動亞克力裝置。游泳裝置為直徑20 cm、高50 cm的亞克力游泳桶，游泳時水深35 cm，水溫(24±1)℃。

1.5 體質量測量分別稱量大鼠造模后第1周、第3周、第5周，即造模后d 8、22、28的體質量。

1.6 行為學檢測造模后d 8、9、22、23、29、30，進行曠場實驗(open field test，OFT)和高架十字迷宮實驗(elevated plus maze test，EPMT)，檢測大鼠的行為學表現。所有行為學檢測均在17 ∶00～23 ∶00進行，OFT后24 h，再進行EPMT實驗。

1.6.1OFT實驗 OFT是檢測大鼠焦慮樣行為和自主活動的經典實驗[2]。曠場裝置由100 cm×100 cm×40 cm的黑色亞克力敞口曠場箱、紅外攝像頭及分析軟件組成。在黑暗的條件下，將大鼠放置于曠場箱中央，攝像頭記錄大鼠5 min的活動，由分析軟件計算出總路程，即代表大鼠的自主活動。每次實驗間隙予體積分數為0.01的苯扎溴銨溶液擦洗曠場箱后，用體積分數為0.75的酒精擦干，以減少動物間的干擾。

1.6.2EPMT實驗 EPMT用于檢測大鼠的焦慮樣行為。大鼠探索開放臂活動減少，代表其有較高的焦慮情緒[6]。高架十字迷宮的裝置由距離地面高36 cm的2條相對開放臂(15 cm×48 cm)和2條相對閉合臂(15 cm×48 cm×40 cm)及中央區(15 cm×15 cm)連接而成。設備上方安裝跟蹤攝像頭，由分析軟件計算出5 min內大鼠進入開放臂次數百分比、開放臂路程百分比及開放臂時間百分比。每次實驗前均用體積分數為0.01的苯扎溴銨溶液清洗大鼠活動區，再用體積分數為0.75的酒精擦干，后將大鼠頭朝固定開放臂放入中央區。

1.7 地塞米松抑制實驗(dexamethasone suppression test，DST)DST是利用SPS-再應激(束縛制動)的模式，檢測血漿ACTH含量，用以反映HPA軸快速負反饋功能[4]。DST分別在造模后d 8和d 22進行。首先，向大鼠皮下注射地塞米松(3 mg·kg-1)，再立即束縛30 min，解除束縛后，用體積分數為0.07的水合氯醛麻醉，而后眼眶靜脈取血。血液用含EDTA的采血管采集，3 000 r·min-1、4 ℃離心10 min后，吸取上清到另一1 mL的EP管，存放于-80 ℃冰箱中。ACTH檢測采用ELISA法，操作方法按照試劑盒說明書進行。

1.8 CORT檢測CORT檢測分別于造模后d 8、22、28進行，乙醚輕度麻醉大鼠后，眼眶靜脈取血，血漿收集及保存方法如上所述。血漿中CORT水平用ELISA法檢測，按照說明書方法操作。每個實驗流程如Fig 1所示，為防止3個實驗間相互影響及重復檢測帶來的干擾，不同實驗及不同觀察時間點均選用不同批次的大鼠獨立進行。

Fig 1 Experimental design

2 結果

2.1 體質量結果各組大鼠體質量變化如Fig 2所示，各組間體質量無明顯差異(P>0.05)。

Fig 2 Effect of GLEXJ on body mass of PTSD model rats after

Week1,n=31;Week4,n=30～32;Week 5,n=23～24

2.2 OFT結果如Fig 3所示，與正常組相比，模型組的總路程在SPS后d 8、22均有下降趨勢，但差異無統計學意義；d 29總路程明顯下降(P<0.01)。GLEXJ和PRX連續給藥14 d，即SPS后d 22，總路程有升高的趨勢，但差異均無統計學意義；連續給藥21 d，即SPS后d 29，總路程均明顯增加(P<0.01)。

Fig 3 Effects of GLEXJ on locomotor

The behavior was presented by total distances in the OFT(1.Control; 2. SPS; 3. PRX; 4. GLEXJ).#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsSPS.

2.3 EPMT結果如Fig 4所示，與正常組相比，SPS后d 9模型組的開放臂時間百分比、開放臂路程百分比差異均無統計學意義，進入開放臂次數百分比則明顯下降(P<0.05)。SPS后d 23、30，模型組的開放臂時間百分比與正常組比較，差異無統計學意義，但是開放臂路程百分比和進入開放臂次數百分比均明顯下降(P<0.05，P<0.01)。GLEXJ組與PRX組連續給藥14 d后，大鼠開放臂時間百分比、開放臂路程百分比、進入開放臂次數百分比有升高的趨勢，但是差異無統計學意義。GLRXJ組連續給藥21 d后，大鼠開放臂時間百分比、開放臂路程百分比有升高的趨勢，但差異無統計學意義，而進入開放臂次數比明顯升高(P<0.01)。PRX組連續給藥21 d后，大鼠開放臂時間百分比差異無統計學意義，開放臂路程百分比和進入開放臂次數百分比均明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

2.4 DST結果如Fig 5所示，SPS后d 8，與正常組相比，模型組的血漿ACTH含量明顯下降(P<0.05)。到d 22時，血漿ACTH仍明顯低于對照組(P<0.01)。GLEXJ組和PRX組連續給藥14 d后，兩組大鼠血漿ACTH含量均明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

2.5 CORT檢測結果如Fig 6所示，SPS后d 8模型組CORT水平與正常組相比，差異無統計意義；d 22模型組CORT水平雖有升高，但差異無統計學意義；d 29，模型組CORT水平明顯升高(P<0.01)。GLEXJ連續給藥14 d后，大鼠CORT水平略有下降，但差異無統計學意義；在連續給藥21 d后，大鼠CORT水平與模型組比較明顯下降(P<0.05)。PRX連續給藥14 d后，大鼠CORT水平與模型組比，差異無統計學意義；連續給藥21 d后，CORT水平明顯下降(P<0.01)。

The behavior was presented by the percentages of time (A), distance; (B), entries; (C) into the open arms: 1.Control; 2. SPS; 3. PRX; 4. GLEXJ.#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsSPS.

3 討論

在PTSD的研究中，其HPA軸功能的改變一直是人們關注的重點。CORT是HPA軸分泌的終末激素，通常用來評價HPA軸的基礎功能。由于PTSD患者HPA軸功能紊亂，機體對這種紊亂的自我調節與適應是一個長期的過程，在此過程中，HPA軸的基礎功能和負反饋功能相互影響，使得皮質醇呈現出長期的動態變化。所以在不同時間點檢測外周血皮質醇水平，結果會不盡相同，或升高或降低或不變[3]。嚙齒動物研究中，CORT的報道也是如此[7-8]。雖然皮質醇含量變化的報道不一致，但是PTSD患者普遍存在著HPA軸負反饋增強的現象[9]。Liberzon等[4]利用SPS-再應激(束縛制動)的研究模式，通過對比造模前后注射皮質醇與不注射皮質醇的大鼠，在束縛30 min后血漿ACTH的含量，發現如果大鼠的HPA軸負反饋增強，則ACTH的含量會明顯下降。我們采用相同的方法研究發現，在SPS后的d 8，模型組大鼠的HPA軸負反饋功能出現增強，而且這種改變到d 22時仍然存在。在本研究中，在不實施再應激的情況下，我們從造模后d 8～29，動態觀察了各組大鼠血漿CORT水平的變化。結果表明，模型組大鼠d 8雖然出現HPA軸負反饋功能增強，但外周血CORT水平并沒有發生改變；d 22時雖然大鼠HPA軸負反饋功能增強仍然存在，但血漿CORT水平卻呈現出升高的趨勢；到d 29血漿CORT水平則明顯升高。雖然血漿CORT水平的檢測結果與一些文獻報道一致[2]，但為什么在HPA軸負反饋增強的情況下，會出現血漿CORT水平不降反升的現象？有研究認為，負反饋增強是HPA軸整體功能紊亂過程中的一種表現，當機體對這種功能亢進逐漸適應時，CORT對ACTH的刺激敏感性下降，進而開始分泌減少[10]。此外，有學者提出，PTSD患者皮質醇的分泌具有時間序列特征，表現為先升高，然后持續高水平，再降低，最后持續在低水平階段[3]。在本研究中，d 29的模型大鼠可能仍處于PTSD發病的早期階段，故CORT水平表現出升高的狀態。隨著機體對HPA軸功能亢進的逐漸適應，CORT水平可能會出現下降。此外還有一些研究發現，PTSD患者皮質醇水平出現不一致的情況除了與檢測時間不同有關外，還可能跟性別有關，皮質醇水平下降的結果通常出現在有關女性PTSD群體的研究中[11]，而在有關男性PTSD群體的研究中，皮質醇常出現升高或不變[12]。本實驗觀察到的CORT升高現象也可能與我們選用的動物性別有關，考慮到♀動物自身的性激素周期性變化可能會影響研究結果[13]，故均選用了♂大鼠。本研究發現，GLEXJ在連續給藥14 d后，能明顯抑制HPA軸負反饋功能的增強，血漿CORT水平呈現下降趨勢；在連續給藥21 d后，大鼠血漿CORT水平明顯下降。實驗結果表明，GLEXJ能調節SPS導致的HPA軸功能紊亂。

Fig 5 Effects of GLEXJ on content

1.Control; 2. SPS; 3. PRX; 4. GLEXJ.#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsSPS

Fig 6 Effects of GLEXJ on levels

1.Control; 2. SPS; 3. PRX; 4. GLEXJ.#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsSPS

OFT是利用大鼠對新環境的探索行為和趨避性，來檢測大鼠自發活動的良好方法，用總路程來評價大鼠的自發活動情況。EPMT則是檢測大鼠焦慮水平的常見方法。EPMT主要測試動物的非條件性反射，利用動物對新異環境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼心理所形成的矛盾沖突，來考察動物的焦慮狀態。進入開放臂次數百分比、開放臂停留時間百分比和開放臂路程百分比越低，代表焦慮水平越高[6]。OFT結果表明，在SPS造模后d 8、22，自主活動均沒有明顯改變，與很多文獻報道一致[2]，但在d 29時自主活動下降。EPMT結果表明，模型組大鼠從造模后d 9開始出現焦慮水平升高，持續到d 30，表現出持久的焦慮，這與其他文獻報道一致[6]。本研究發現，GLEXJ在連續給藥14 d后能明顯改善SPS引起的大鼠焦慮樣行為，在連續給藥21 d后能明顯提高大鼠的自主活動能力。研究結果表明，GLEXJ能明顯改善SPS導致的行為學異常。

大量的研究發現，HPA軸功能的紊亂是導致焦慮抑郁樣行為出現的重要機制。一般情況下，當機體面對應激，首先是交感神經系統做出快速反應，然后HPA軸功能激活，調節較長時間的應激反應，故HPA軸功能紊亂時會導致機體出現行為障礙。本研究發現，當SPS大鼠HPA軸出現負反饋增強時，盡管當時CORT水平沒有變化，但焦慮水平明顯升高，這與文獻報道一致[8]。HPA軸的負反饋功能主要受前額葉皮質-海馬-杏仁核等腦區的糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor，GR)/鹽皮質激素受體(mineralocorticoid receptor，MR)和促腎上腺皮質激素釋放因子1型受體(corticotropin-releasing factor-1 receptor，CRF1R)表達的影響。近年來研究表明，這些腦區中MR和GR的表達對焦慮、恐懼情緒反應等起重要調節作用[14]，杏仁核中CRF1R的表達增多，能導致焦慮樣行為的出現[15]。本研究結果表明，GLEXJ抑制了PTSD模型大鼠HPA軸負反饋功能的增強，改善了PTSD大鼠的行為異常，其作用機制可能與調節HPA軸功能紊亂有關。但GLEXJ是如何影響HPA軸的高位調節中樞，以及與HPA軸負反饋密切相關的激素及其受體的關系尚不清楚。這將是我們今后進一步深入研究的內容。