三株紅樹林來源鏈霉菌的鑒定及抗菌活性研究

鄭紅蕓，吳 越，葉景靜，陳建宏，蔣蓮秀，何 義，黃大林

(1. 桂林醫學院基礎醫學院微生物實驗室，廣西 桂林 541004；2. 渭南職業技術學院護理學院，陜西 渭南 714026)

抗生素耐藥性問題變得越來越嚴重，急需尋求新型抗生素來解決抗生素耐藥這一問題。放線菌作為一類重要的微生物藥用資源，可產生抗生素、抑制劑、酶等，在醫藥行業中發揮著重要作用。隨著生物技術的不斷發展，種類豐富、結構多樣的放線菌不斷被挖掘出來。在微生物次級代謝產物研究中，現已發現天然生物活性物質中有40%分離自放線菌，其中臨床和農業生產中使用的150多種抗生素中，有2/3來自于放線菌[1-2]。作為產生抗生素的最有潛力的生產者，放線菌中的鏈霉菌受到了極大關注。

普通陸地環境中的土壤是鏈霉菌獲取的重要途徑，但是隨著人們的不斷挖掘，陸地環境內鏈霉菌的獲取率已經越來越低，所以研究者們把研究方向轉向了代謝途徑特殊的紅樹林等特殊生境的微生物研究[3]，以此來尋求具有特殊生物活性的新型抗生素類化合物。多個紅樹林淤泥放線菌研究結果顯示，鏈霉菌為紅樹林淤泥放線菌的多產菌屬，豐富的鏈霉菌種類大大增加了篩選出藥用資源的機率。所以本研究地點選擇了研究相對較少、物種豐富、污染少的廣西茅尾海紅樹林[4]，開展了相關研究。有研究者在此處獲得了多樣性豐富的放線菌，并且發現了許多具有抑菌活性的放線菌菌株[5]。本文主要對廣西茅尾海紅樹林中獲得的3株鏈霉菌從抗菌活性、系統發育樹和生物學特征進行研究，希望通過本研究為尋找具有開發價值的新抗生素提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品 3株分離自廣西茅尾海紅樹林自然保護區根圍淤泥中的鏈霉菌。

1.1.2培養基 ① 分離培養基如下：M1(棉子糖組氨酸培養基)：棉子糖5 g、KNO31 g、L-組氨酸1 g、CaCl22 g、NaCl 1 g、MgSO4·7H2O 1 g、K2HPO41 g、瓊脂20 g、海水600 mL、蒸餾水400 mL，pH 7.2；M2(海藻糖-脯氨酸培養基)：海藻糖5 g、脯氨酸1 g、(NH4)2SO41 g、NaCl 1 g、CaCl22 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 1 g、復合維生素 1 mL、瓊脂18 g、土壤浸汁30 mL、海水500 mL、蒸餾水500 mL，pH 7.2；M3[淀粉酪素培養基(篩選嗜鹽或耐鹽的菌)][6]：可溶性淀粉10 g、干酪素0.3 g、KNO32 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、NaCl 30 g、K2HPO42 g、CaCO30.02 g、FeSO410 mg、瓊脂15 g、土壤浸汁30 mL、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2；M4(ISP5培養基)：L-天門冬酰胺1 g、甘油10 g、K2HPO41 g、微量鹽1 mL、瓊脂15 g、土壤浸汁30 mL、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。② 純化選用培養基：ISP2固體培養基。③ 發酵選用培養基：ISP2液體培養基。④ 藥敏試驗菌株選用培養基：腸球菌耐藥株2800(Enterococcusfaecalis)選用BHI培養基培養。Mueller-Hinton(M-H)培養基(英國OXOID)用于培養其他藥敏試驗菌株。

1.1.3抑制劑 抑制劑分別為放線菌酮50.0 mg·L-1，重鉻酸鉀25.0 mg·L-1，萘啶酮酸25.0 mg·L-1

1.1.4藥敏試驗測試菌株 腸球菌耐藥株2800，由廣東汕頭大學提供；銅綠假單胞菌敏感株ATCC27853和耐藥株2774、金黃色葡萄球菌敏感株ATCC29213和耐藥株ATCC43300、肺炎克雷伯菌敏感株ATCC10031和耐藥株ATCC700603、大腸埃希菌敏感株ATCC25922、糞腸球菌敏感株ATCC33186和耐藥株VRE310681、鮑曼不動桿菌敏感株ATCC19606和耐藥株2799，均由中國醫學科學院醫藥生物技術研究所提供。

1.1.5試劑與儀器 DNA提取用Chelex100樹脂，購于美國Bio-Rad公司；2×EasyTaq Supermix、放線菌酮，購于北京全式金生物技術有限公司；萘啶酮酸與PCR引物(27F, 1492R)，購于上海生工生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純。Autoclave MLS-3750型高壓蒸汽滅菌鍋(日本Sanyo公司)；PCR擴增儀Veriti96 well fast thermal cycler(美國Applied Biosystems公司)；YT-CJ-1ND超凈工作臺(北京亞泰科隆儀器有限公司)；小型離心機Centrifuge1-14(德國Sigma公司)；旋轉蒸發儀OSB-2100(日本EYELA公司)；電泳儀DYY-6C(北京市六一儀器廠)；全恒溫培養箱ZDP-2120、旋轉式搖床ZHWY111C(上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1土樣制備 參考吳越等[7]的土壤處理方式，將新鮮海泥放于無菌平皿中，室溫條件超凈臺內自然風干后，用無菌研缽將干泥塊研磨成細粉末狀。分別稱取5 g不同地點的粉末，于45 mL(含有無菌玻璃珠)無菌水中溶解，180 r·min-1、28 ℃搖床振蕩6 h；吸取1 mL土樣溶解懸液于9 mL無菌水中，然后稀釋成4個梯度，分別為100、10、1、0.1 g·L-1，選擇終濃度為10、1、0.1 g·L-1，分別吸取0.2 mL于4種不同分離培養基平皿上，進行涂布，完成后，置28 ℃恒溫培養箱培養，定期觀察平板內菌落的生長情況。

1.2.2菌株的分離與保存 連續培養2～8周后，觀察菌落的形態及生長情況。肉眼判斷觀察后，挑取形態似放線菌的菌落，用竹簽挑取單個菌落于改良ISP2固體培養基，并三區劃線，以得到純化的單菌落。同時，將菌株以無菌的20%甘油作為保護劑,置于-80 ℃冰箱保存，以20%無菌脫脂牛奶作為保護劑，冷凍干燥后，置4 ℃冰箱保藏。

1.2.316S rRNA基因序列的測定和系統發育學分析 ① 采取Chelex-100法提取基因組DNA[8]。擴增引物為通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。總體積為50 μL的PCR反應體系：27F(10 μmol·L-1)1.5 μL，1492R(10 μmol·L-1)1.5 μL，模板2.5 μL，2×Easy taq supermix 25 μL，無菌水19.5 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃后延伸10 min。② PCR產物選用1%瓊脂糖凝膠110 V、30 min電泳檢測；將篩選出的陽性結果交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。③登錄http://www.ezbiocloud.net/identify和NCBI數據庫，對測序所獲16S rRNA基因序列進行相似性比對。分別選取相似性較高且有效發表菌株的16S rRNA基因序列作為參比對象，然后采用Clustal W進行多序列比對[9]，用MEGA 7.0軟件[10]通過鄰接法(Neighbor-Joining)進行聚類分析，并進行系統進化樹[11]的構建，系統進化矩陣根據Kimura-2[12]模型估計，重復取樣1 000次進行自展值(Bootstrap value)分析，以此來評估系統進化樹拓撲結構的相對穩定性。

1.2.4發酵粗提物抗菌活性檢測

1.2.4.1檢定樣品的制備 挑取生長3～4 d的菌株，于裝有130 mL發酵培養基的500 mL錐形瓶中，接種3瓶，搖床180 r·min-1，溫度28 ℃培養6～7 d。培養結束后，將發酵液4 500 r·min-1離心30 min，留取發酵粗提物30 mL到樣品瓶中，剩余部分選用等體積的乙酸乙酯萃取，酯相(E1-3)旋蒸濃縮干燥后，用3 mL甲醇溶于樣品瓶中備用。留取萃取后的水相(A1-3)60 mL，揮發干燥后，用3 mL 1 ∶1甲醇水溶液溶解后備用。丙酮浸泡菌體(M)24 h后，采用與水相制備相同的方法。

1.2.4.2藥敏試驗測試菌株的配制 將平皿上的藥敏試驗菌株分別接種于裝有20 mL MH與BHI液體培養基的100 mL錐形瓶中，搖床設置36 ℃、180 r·min-1培養12 h，將菌懸液按0.8%濃度，加入到溫度降至55 ℃左右無菌MH和BHI瓊脂培養基中，搖勻，使其終濃度為0.5麥氏濃度單位，以每皿15～20 mL傾倒至培養皿內，置4 ℃冰箱備用。

1.2.4.3樣品抗菌活性篩選 選用牛津杯法，將200 μL發酵粗提物加入到含有藥敏試驗測試菌株的平皿內，36 ℃培養箱培養12～18 h。采取紙片擴散法，將直徑為6 mm、厚度為2 mm的圓形無菌濾紙片上，滴加60 μL已制備完成的E、A、M3類樣品，待其揮發干燥后，貼于含有測試菌的培養皿上，36 ℃培養箱培養12～24 h后，觀察并測量抑菌圈的大小。

2 結果

2.1 抗菌活性利用藥敏試驗測試菌株對未經濃縮的發酵粗提物采用牛津杯法進行抗菌活性檢測，檢測結果顯示，菌株K51M對金黃色葡萄球菌敏感株與耐藥株均具有明顯的抑菌作用，抑菌圈大小分別為13.1 mm和9.6 mm(Fig 1)，其余兩株鏈霉菌未出現抑菌圈。

Fig 1 Antibacterial activity of crude fermentation extract(K51M)

A:Antimicrobial activities of strain K51M against Staphylococcus aureus sensitive strain by Oxford cup method; B:Antimicrobial activities of strain K51M against Staphylococcus aureus resistant strain by Oxford cup method.

將發酵液濃縮后，采用紙片法進行抗菌活性檢測。檢測結果顯示(Tab 1)，菌株K57M對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均具有較好的抑菌活性。菌株K131M對大多數藥敏菌株產生了明顯的抑菌作用，特別是對金黃色葡萄球菌敏感株和銅綠假單胞菌的抑菌活性更強；而菌株K51M對革蘭陽性測試菌都表現出了較好的抗菌活性(Fig 2)。

2.2 菌落特征經選擇培養基培養，3株菌均在改良ISP2培養基上生長良好，并且菌落緊貼培養基生長，干燥、多皺褶，具有典型的放線菌形態。其中K57M菌落開始呈現白色，后逐漸生長為灰白色，布滿孢子絲，質地較密，且不易被挑取。K131M質地較密，菌落為黃色，白色孢子絲布滿菌落，生長周期較長，極易挑起；K51M菌落開始為灰白色，后面孢子產生孢子絲布滿菌落，但孢子絲不易散落，菌落可使培養基著色，觀察培養基顏色變化發現產生可溶性灰褐色色素，并且菌落不容易從培養基上挑取(Fig 3)。

2.3 基于16S rRNA構建3株放線菌菌株的系統發育樹測序獲得3株菌株的16S rRNA基因序列后，登錄Ezbiocloud進行序列比對，并構建系統進化樹，選取相似性較高的菌株序列作為參比對象(Fig 4)。

Tab 1 Screening results of antimicrobial activity of strains K57M, K131M and K51M(mm)

Gram-positive bacteria (S.a: Staphylococcus aureus, E.f: Enterococcus faecalis); Gram-negative bacteria (P.a: Pseudomonas aeruginosa; E.c: Escherichia coli; K.p: Klebsiella pneumoniae; A.b: Acinetobacter baumannii). S: Sensitive strain; R: Resistant strain.

Fig 2 Partial results of antibacterial activity of three Streptomyces strains

A:Antibacterial activities of Klebsiella pneumoniae sensitive strain; B and C:Antibacterial activities of Staphylococcus aureus sensitive strain.

Fig 3 Colony morphology of three strains of Streptomyces on culture medium and under macroscopic stereomicroscope

從比對結果中發現，菌株K57M與菌株StreptomycespolymachusKM229363 T258T的相似率為98.30%，在N-J系統進化樹中，與部分有效發表的菌株形成一簇，并且形成了獨立的進化分支，說明菌株K57M極有可能為鏈霉菌屬內潛在的新種，接下來將開展多相分類學相關的研究。菌株K51M在系統進化樹中發現，其與鏈霉菌屬中的不產色鏈霉StreptomycesachromogenesAB184109 NBRC 12735T的序列最為相近，相似率為99.09%，初步判斷其可能為這個種的變種。菌株K131M比對結果顯示其相似率為99.87%，在進化樹分支中可信度較高，提示可能為Streptomycescoeruleoprunus下的一個變種。

3 討論

紅樹林是位于熱帶與亞熱帶潮帶間的植物群落，物種多樣性造就了豐富的微生物資源[13]。目前，紅樹林活性物質及其代謝產物已經成為研究的熱點。放線菌作為紅樹林生境中一組特殊的微生物群落，從中挖掘到的放線菌新物種越來越多，根據不同生態環境分為植物內生、陸地、海洋放線菌[14]。已有文獻報道，從紅樹林淤泥中篩選得到的的放線菌多于植物內生放線菌[15]，其中鏈霉菌屬和小單孢菌屬是紅樹林淤泥放線菌中的優勢菌屬，并且種類豐富。紅樹林淤泥放線菌中的優勢菌屬鏈霉菌屬于高G+C含量的有機化能好氧型革蘭陽性放線菌，不僅種類豐富，而且近年來大多數抗菌、抗腫瘤的次級活性產物主要來源于鏈霉菌。如Yu等[16]從1株來源于廈門紅樹林的鏈霉菌屬中獲得了1個新的大環內酯類化合物，具有抗真菌及抗腫瘤的作用；Zhang等[17]從1株鏈霉菌中分離獲得了2個新化合物，并且檢測到對大腸桿菌能夠產生較好的抗菌活性。因此，來源于紅樹林的鏈霉菌具有潛在的研究及開發價值。

Fig 4 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16Sr RNA gene sequences of three strains of genus Streptomyces

廣西茅尾海紅樹林自然保護區為省級紅樹林自然保護區，占據著獨特的地理環境[18]，其紅樹群落較為簡單，主要為桐花樹、桐花樹-無瓣海桑群落，還有伴生植物-互花米草。此次就廣西茅尾海的3株鏈霉菌進行生物特征研究及活性鑒定，發現這3株菌株的抗菌活性具有一定的對比差異性。首先，菌株K57M在測序比對后，通過構建進化樹，初步鑒定為潛在的鏈霉菌屬內的新物種，并且對金黃色葡萄球菌敏感株和銅綠假單胞菌耐藥株產生了抑菌活性，說明其抗菌能力較為窄譜；其次，菌株K131M對于藥敏試驗測試菌株具有廣譜抗菌活性，且抑菌活性較好；再者，菌株K51M通過牛津杯試驗和紙片法試驗，均表現出了較好的抗菌能力，特別是紙片擴散法篩選結果顯示，它對于革蘭陽性與革蘭陰性菌均具有較好的抑菌作用，說明其抗菌能力較為廣譜。通過統計可以看出，這3株菌株對金黃色葡萄球菌均產生了較好的抑菌活性，而且在致病菌種類和抗菌能力上均有所不同。這也為我們篩選特異性次級代謝產物提供了一定的基礎和微生物來源。

紅樹林豐富的鏈霉菌及大量的研究結果表明，該屬的次級代謝產物仍然具有巨大的研究潛力。通過對廣西茅尾海紅樹林根圍淤泥中放線菌研究發現，其資源豐富，鏈霉菌種類多樣，這不僅為新活性次級代謝產物的篩選提供了微生物資源，同時為微生物來源的新型抗生素的開發提供了基礎。

(致謝：本實驗在中國醫學科學院醫藥生物技術研究所孫承航老師實驗室完成，特別感謝實驗室老師及同學的指導與幫助！)