在“三明治”培養大鼠原代肝細胞中研究利福平及聯用丹參酮ⅡA對普伐他汀經BSEP轉運的影響

劉 蕾，楊玉潔，王 凌，蔣學華

(四川大學華西藥學院，四川 成都 610041)

膽汁酸外排泵(bile salte export pump，BSEP)是重要的膽汁酸外排轉運體，主要介導一價膽酸鹽的轉運。BSEP介導的膽汁酸外排在膽汁酸循環中是重要的限速步驟。有研究表明，編碼BSEP的基因ABCB11發生突變，可導致進行性家族性肝內膽汁淤積，抑制BSEP的轉運能力也可導致膽汁淤積[1]。利福平(rifampin，RFP)是治療結核病的一線藥物。在臨床使用中，RFP給藥劑量大，服藥周期長，常引發肝損傷等不良反應，其中，以膽汁淤積型肝損傷最為常見[2]。目前，RFP致淤膽的機制尚不清楚，是否可能通過抑制膽汁酸轉運體BSEP的轉運能力導致膽汁淤積，需要進一步研究。丹參酮 ⅡA(tanshinone ⅡA，TAN ⅡA)是中藥丹參的脂溶性活性成分，具有抗氧化、抗纖維化、保肝等作用。TAN ⅡA能改善腫瘤壞死因子和過氧化氫所致的肝細胞損傷[3]，也能激活NF-E2相關因子2(NF-E2-related factor 2， Nrf2)信號通路，預防對乙酰氨基酚引起的肝損傷[4]。有研究表明，BSEP的啟動子區域存在Nrf2的結合位點[5]。本課題組前期研究發現，TAN ⅡA能夠激活Nrf2，誘導下游BSEP的表達。但目前尚未有研究報道TAN ⅡA對BSEP轉運能力的影響，所以我們猜想，TAN ⅡA是否能增加轉運體BSEP的轉運能力，對抗RFP所致的膽汁淤積型肝損傷。

“三明治”培養大鼠原代肝細胞模型(sandwich-cultured rat hepatocytes，SCRH)是指將大鼠原代肝細胞鋪于鼠尾膠與基質膠之間，形成夾層培養。原代肝細胞在該模型下培養3～5 d，肝細胞間能夠形成膽管樣結構，且轉運體和代謝酶的表達維持較高水平，可以較好地模擬體內環境，是體外研究肝臟轉運體功能的主要模型[6]。本文旨在SCRH中考察RFP及聯用TAN ⅡA對BSEP轉運能力的影響，進一步闡明RFP導致膽汁淤積的機制，同時也為尋找有效減輕RFP膽汁淤積的藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康SD大鼠，♂，體質量(250±20)g，由成都達碩實驗動物有限責任公司提供，生產許可證號：SCXK(川)2015-030。采用標準飼料喂養，自由飲水及進食，適應性飼養1周。飼養環境采用晝夜對半的循環模式，控制相對濕度(75±15)%，溫度(25±5)℃。所有動物實驗均按照四川大學關于實驗動物的飼養和實驗準則進行，并且通過了四川大學華西藥學院動物保護委員會批準。

1.2 藥物與試劑RFP(純度99%，批號：S01023 YA14)、TAN ⅡA(純度98%，批號：Y20J8C49264)，均購自上海源葉生物科技有限公司；格列本脲(純度99%，批號：A0225A，大連美侖生物技術有限公司)；普伐他汀(純度98%，批號：C1721027，阿拉丁)；卡馬西平(純度99.7%，批號：100142-201004，中國藥品生物制品檢定所)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、BSA牛血清白蛋白，均購自萬類生物科技有限公司；EGTA購自Sigma公司；含Ca2+/Mg2+Hanks緩沖液、不含Ca2+/Mg2+Hanks緩沖液，購自Solarbio公司；Ⅱ型膠原酶，購自Gibco公司；Matrigel膠、鼠尾膠，均購自Corning公司；甲醇、乙腈均為色譜級，購自Spectrum公司；色譜級甲酸，購自DIKMA公司。

1.3 儀器API 3000三重四極桿質譜(美國AB Sciex公司)聯用高效液相色譜儀(日本SHIMADZU)；Minipuls 3蠕動泵法國(GILSON)；渦旋振蕩器、酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；H-1600A臺式高速離心機 (上海利鑫堅離心機有限公司)；倒置相差生物顯微鏡(上海巴拓儀器有限公司)；二氧化碳細胞培養箱日本(Sanyo公司)。

1.4 SCRH模型的建立采用半原位膠原酶灌流法分離大鼠原代肝細胞。禁食24 h的SD大鼠腹腔注射500 IU·kg-1肝素鈉抗凝，并用4 mg·kg-1水合氯醛麻醉。75%酒精消毒大鼠腹部，在無菌條件下打開腹腔，游離門靜脈與下腔靜脈，門靜脈插管。用EGTA灌流液勻速灌注，流速為20 mL·min-1，待肝臟腫脹時剪開下腔靜脈，繼續灌注10 min肝臟變成土黃色后停止灌流；完整摘除肝臟，用無菌PBS清洗3次，在無菌條件下鈍性撕破肝包膜，撕碎肝臟并轉移到無菌離心管中，加入20 mL Ⅱ型膠原酶，37 ℃水浴中震蕩7 min；100目篩網過濾肝細胞懸液，加入含5% FBS的DMEM培養基20 mL，50×g、4 ℃離心3 min，重復2次，用10 mL相同培養基重懸沉淀，加入5 mL密度為1.08 kg·L-1的Percoll，混勻后，200×g、4 ℃離心5 min，所得沉淀以含5% FBS的DMEM培養基重懸，將細胞活率在90%以上的細胞按5×108·L-1的密度接種于鋪有鼠尾膠的細胞培養板上，4 h后更換新的含5% FBS的DMEM培養基，以去除未貼壁細胞。培養24 h后，更換含Matrigel膠(0.25 g·L-1)的無血清DMEM培養基，以形成“三明治”夾層狀態，隨后每24 h更換新的無血清DMEM培養基，直至d 4長出膽管。

1.5 MTT實驗將新鮮分離的大鼠原代肝細胞按2.5×104個/孔接種于鋪有鼠尾膠的96孔板中，按“三明治”模型的培養條件培養至d 4，分別以RFP(0、0.5、1、2、5、10、25、50、80、100 μmol·L-1)，TAN ⅡA(0、0.5、1、2、5、10、25、50、80、100 μmol·L-1)聯用50 μmol·L-1RFP，以及格列本脲(0、1、2、4、10、20、50、100、160、200 μmol·L-1)處理細胞12、24、48 h；以濃度為0、0.2、0.5、1、2、5 μmol·L-1普伐他汀處理細胞6、12、24 h。于相應的時間點棄去含藥培養基，改用5 g·L-1MTT孵育細胞4 h，吸棄MTT，加入150 μL DMSO震蕩10 min以充分溶解結晶物甲臜。在492 nm波長下測定各孔的吸光度值。細胞抑制率計算公式為：細胞抑制率/%=(Acontrol-Atest)/Acontrol×100%

1.6 液相色譜-質譜條件色譜柱：phenomenex Luna 3u C18(2)(50 mm×2.00 mm 3 μm)；流動相：A相為0.1%甲酸的水溶液；B相為乙腈，梯度洗脫(0～0.5 min 10% B；0.51～1.5 min 10%～90% B；1.5～3 min 90% B；3.01～4.5 min 90%～10% B；4.51～5 min 10% B)；流速為0.4 mL·min-1；柱溫為40 ℃，進樣量10 μL。離子源為ESI，采用多反應監測模式(MRM)，正離子掃描，離子噴射電壓(IS)為5.0 kV；氣簾氣(CUR)為82.74 kPa；碰撞氣(CAD)為68.95 kPa；霧化氣(NEB)為55.16 kPa。普伐他汀和內標卡馬西平的離子對分別為m/z 447.1→327.4、m/z 237.1→194.1，去簇電壓(DP)分別為79 V、20 V，碰撞能量分別為30 V、12 V。

1.7 溶液配制用90%的甲醇溶液配制濃度為240.0 mg·L-1的普伐他汀儲備液和濃度為3.000 g·L-1的卡馬西平儲備液。將普伐他汀儲備液用50%的甲醇溶液繼續稀釋為0.600、1.200、3.000、6.000、12.00、24.00、30.00 mg·L-1的系列普伐他汀工作溶液。將卡馬西平儲備液用50%的甲醇溶液稀釋為4.500 mg·L-1的內標溶液。

1.8 原代肝細胞樣品的處理方法取原代肝細胞裂解液90 μL，向其中加入50%甲醇溶液10 μL以及內標工作溶液10 μL，渦旋1 min；加入300 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋振蕩3 min，12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液80 μL入進樣瓶中，依次放置于自動進樣器樣品盤中，進樣10 μL分析。記錄普伐他汀面積(Aanalyte)與內標峰面積(AIS)，代入標準曲線中，計算樣品中濃度。

1.9 細胞轉運實驗普伐他汀是BSEP的已知底物[7]，本文用普伐他汀在膽管中的濃度評價RFP及聯用TAN ⅡA對BSEP轉運能力的影響。SCRH形成膽管結構后，用含Ca2+/Mg2+的Hanks孵育細胞，細胞間的膽管結構保持完整，進入細胞的普伐他汀可被轉運到膽管中；用不含Ca2+/Mg2+的Hanks孵育細胞，細胞間膽管結構被破壞，細胞內的普伐他汀被轉運到培養液里，由此差值可得排入膽管中普伐他汀的濃度[8]。SCRH培養至d 4，分別以格列本脲(100 μmol·L-1)、RFP(10、25、50 μmol·L-1)、TAN ⅡA(5、10、20 μmol·L-1)聯用50 μmol·L-1RFP處理細胞12、24、48 h。其中，格列本脲是BSEP的已知抑制劑，作為陽性對照藥。隨后用37 ℃預熱的含Ca2+/Mg2+或不含Ca2+/Mg2+的Hanks孵育細胞15 min后吸棄，加入含1 μmol·L-1普伐他汀的Hanks孵育20 min，用冰冷的Hanks快速清洗細胞3次終止轉運，用反復凍融法裂解細胞并進行BCA蛋白定量。細胞裂解液樣品按“1.8”項下操作，計算樣品中普伐他汀的濃度及膽管外排指數(bile efflux index，BEI)：BEI=(Acell+bile-Acell)/Acell+bile×100%，其中，Acell+bile為在含Ca2+/Mg2+時細胞和膽管結構內普伐他汀的蓄積量；Acell為在不含Ca2+/Mg2+時細胞內普伐他汀的蓄積量。

2 結果

2.1 藥物對細胞活性的影響Fig 1的MTT結果顯示，RFP、TAN ⅡA聯用RFP(50 μmol·L-1)、格列本脲、普伐他汀濃度分別在0～50 μmol·L-1、0～25 μmol·L-1、0～100 μmol·L-1、0～2 μmol·L-1范圍內，對細胞的生長抑制率低于20%，幾乎不抑制細胞生長。最終選定RFP的給藥濃度為10、25、50 μmol·L-1，TAN ⅡA的給藥濃度為5、10、20 μmol·L-1，格列本脲的給藥濃度為100 μmol·L-1，普伐他汀的給藥濃度為1 μmol·L-1。

2.2 普伐他汀UPLC-MS/MS的方法學考察在選定的液相-質譜條件下，分別測定空白細胞裂解液、空白細胞裂解液+普伐他汀、空白細胞裂解液+卡馬西平、空白細胞裂解液+普伐他汀+卡馬西平。Fig 2結果表明，細胞裂解液中的其他雜質不干擾普伐他汀和內標卡馬西平的分離測定，普伐他汀和卡馬西平的保留時間分別為1.78 min、1.85 min。

Fig 1 Growth inhibitions on rat primary hepatocytes by RFP(A), TAN ⅡA(B), glibenclamide(C),

Fig 2 Representative chromatograms of pravastatin and internal standard(carbamazepine) in cell lysates

A: Blank rat primary hepatocytes lysis solution; B: Blank rat primary hepatocytes lysis solution with pravastatin; C: Blank rat primary hepatocytes lysis solution with carbamazepine; D: Blank rat primary hepatocytes lysis solution with pravastatin and carbamazepine.

Fig 3 The standard curve diagram of pravastatin in cells

按“1.8”項下操作，將普伐他汀系列工作溶液加入空白細胞裂解液中，制備成濃度為60.0、120.0、300.0、600.0、1 200、2 400、3 000 μg·L-1的標準曲線溶液，以待測物和內標峰面積的比值(Y)為縱坐標，以普伐他汀的濃度為橫坐標，進行加權回歸，權重為1/C2，得到回歸方程和相關系數：Y=0.00148X+0.0173(r2=0.9954),表明在60.00～3 000 μg·L-1濃度范圍內普伐他汀線性良好，定量下限為60.00 μg·L-1。標準曲線代表圖見Fig 3。

按“1.8”項下操作，用空白細胞裂解液將普伐他汀工作溶液稀釋為60.00、120.0、600.0、2 250 μg·L-1的極低、低、中、高4個濃度的質控樣品，每個濃度制備6份。其中，用極低、低、中、高濃度的質控樣品考察精密度與準確度。由Tab 1結果可知，普伐他汀極低、低、中、高濃度質控樣品的準確度分別為(104.67±4.27)%、(106.80±6.45)%、(107.53±8.56)%、(90.80±4.49)%，表明方法準確度良好，日內精密度在2.41%～11.74%之內，日間精密度在4.17%～11.93%之內，表明方法精密度良好。用低、中、高濃度的質控樣品考察提取回收率，Tab 1結果表明，低、中、高3個濃度樣品的提取回收率分別為106.06%、88.39%、108.09%。用低、高兩種不同濃度的質控樣品考察基質效應與穩定性，結果如Tab 2所示，低、高濃度普伐他汀的相對基質效分別是3.8%、4.4%。穩定性結果如Tab 3所示，與0 h相比，室溫放置4 h、自動進樣器(4 ℃)放置8 h、-70 ℃放置10 d以及反復凍融3次后，樣品測得值的偏差均小于15%。因此，普伐他汀在以上條件下穩定性良好。

Tab 1 Accuracy, precision and extraction recovery of pravastatin in cell

Tab 2 Matrix effect of pravastatin in cell

Tab 3 Stability of pravastatin in cell

2.3 普伐他汀在SCRH的膽管外排格列本脲、RFP、TAN ⅡA孵育細胞12、24、48 h后，普伐他汀在膽管中的濃度變化結果如Fig 4所示。與空白對照組比，格列本脲明顯降低膽管內普伐他汀的濃度(P<0.01)，RFP也能降低膽管內普伐他汀的濃度，其中RFP高濃度組處理細胞12、24、48 h后，膽管內的普伐他汀濃度分別降低至對照組的22.2%、24.2%、19.6%，差異具有顯著性(P<0.01)；與高濃度RFP組比，當RFP與不同濃度的TAN ⅡA聯用后，膽管內普伐他汀的濃度呈增加趨勢，其中RFP與TAN ⅡA高劑量組聯合用藥處理細胞12、24、48 h后，膽管內普伐他汀濃度分別增加至RFP高劑量組的3.81倍、2.51倍、3.50倍，差異具有顯著性(P<0.05)。

此外，BEI也是評價藥物膽管外排的重要指標，格列本脲、RFP、TAN ⅡA對普伐他汀BEI的影響結果見Fig 5。結果顯示，與空白對照組相比，格列本脲能明顯降低普伐他汀的BEI(P<0.05)，RFP也能降低普伐他汀的BEI，其中高濃度RFP處理細胞12、24、48 h均能明顯降低普伐他汀的BEI，分別是對照組的42.6%、45.2%、38.4%，差異具有顯著性(P<0.01)；與高濃度RFP組相比，RFP與TAN ⅡA聯用后，普伐他汀的BEI呈上調趨勢，其中高濃度TAN ⅡA上調趨勢最明顯，處理細胞12、24、48 h后，普伐他汀的BEI分別增加至高濃度RFP組的1.51倍、1.91倍、2.74倍，差異具有顯著性(P<0.01)。由此說明，RFP能夠抑制BSEP的轉運能力，TAN ⅡA與RFP聯用后能夠逆轉RFP對BSEP轉運能力的抑制作用。提示RFP致淤膽的機制可能與抑制BSEP的轉運能力有關，TAN ⅡA能夠上調BSEP的轉運能力，具有治療RFP所致膽汁淤積的潛力。

3 討論

原代肝細胞最經典的提取方法是Seglen兩步灌流法[9]，但該法膠原酶用量大、灌流時間長，本文選用半原位膠原酶灌流法提取大鼠原代肝細胞，并對該方法進行了改良。分別對膠原酶的類別、濃度、溫度、消化時間等條件進行考察，發現影響原代細胞得率和活率的關鍵因素包括：① 膠原酶的類別：本研究分別嘗試用Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶提取原代肝細胞，發現在相同操作下，Ⅱ型膠原酶處理后的細胞得率高于Ⅰ型膠原酶和Ⅳ型膠原酶；② 灌流速度：灌流速度快會對肝臟造成機械性損傷，降低細胞活率；灌流速度慢，肝臟易淤血，導致灌流不充分；反復摸索后發現，20 mL·min-1的灌流速度能快速清除肝臟淤血并能保證細胞活率；③ 消化時間：膠原酶消化時間過短，細胞得率低；消化時間長，細胞因缺氧而死亡，影響細胞活率。因此，本文最終采用42 ℃、0.05% Ⅱ型膠原酶離體消化肝臟10 min。相比于傳統方法，該實驗條件既保證了細胞得率和活率，又大大降低了實驗成本。

Fig 4 Effects of rifampin and tanshinone ⅡA on accumulation of pravastatin in bile

1：Control;2:Glibenclamide;3:RFP 10;4:RFP 25;5:RFP 50;6:RFP 50+TAN 5;7:RFP 50+TAN 10;8:RFP 50+TAN 20.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsRFP 50 group

用HPLC-MS/MS測定普伐他汀血樣濃度時，常用的樣品前處理方法有液-液萃取法[10]、固-液萃取法[11]。這些方法操作繁瑣、實驗成本高。相比于血液樣品，細胞樣品成分較單一，本文采用乙腈沉淀蛋白法處理樣品，發現普伐他汀響應好、回收率高，滿足生物樣品的分析要求。此外，流動相也是影響藥物定量分析的重要因素，通過考察乙腈-水(補充0.1%甲酸)、甲醇-水(補充0.1%甲酸)對普伐他汀測定的影響，發現有機相為乙腈時藥物峰形平滑，響應好；有機相為甲醇時藥物峰出現裂峰，響應低，且有拖尾現象。故最終確定用乙腈沉淀蛋白法處理樣品，流動相用乙腈-水(補充0.1%甲酸)。

Fig 5 Effects of rifampin and tanshinone ⅡA on BEI of

1：Control;2:Glibenclamide;3:RFP 10;4:RFP 25;5:RFP 50;6:RFP 50+TAN 5;7:RFP 50+TAN 10;8:RFP 50+TAN 20.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsRFP 50 group

藥源性肝損傷是藥物撤市的原因之一，國際醫學組織理事會將藥物性肝損傷分為3類：肝細胞損傷型、膽汁淤積型和混合型[12]。利福平造成的肝損傷是膽汁淤積型肝損傷。膽汁淤積是多種原因導致的膽汁生成、分泌及轉運障礙，而鈉離子-牛磺膽酸共轉運蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide， NTCP)、有機陰離子轉運多肽( organic anion transporting polypeptide，OATP)、多藥耐藥相關蛋白2(multidrug-associated protein 2，MRP2)、BSEP等轉運體在膽汁酸的轉運中發揮了重要作用。研究發現，RFP能抑制Oatp2的攝取[13]；也能抑制Mrp2的功能，從而減少膽紅素和膽汁酸的轉運[14]。本研究發現，RFP能夠抑制BSEP的轉運能力，這可能是RFP導致膽汁淤積的原因之一。此外，中藥療效穩定、副作用較小，常與西藥聯合用藥降低西藥的毒副作用。目前常用的保肝藥物較多，如姜黃、三七、冬蟲夏草等。丹參也是重要的保肝藥物，其主要有效成分是TAN ⅡA，臨床上將TAN ⅡA磺酸鈉和還原性谷胱甘肽聯合使用治療膽汁淤積型藥物性肝炎，TAN ⅡA磺酸鈉通過誘導CYP450的活性，加速肝毒性物質代謝，減少肝損傷。本研究發現，TAN ⅡA能夠逆轉RFP對BSEP轉運能力的抑制作用，表明TAN ⅡA可能通過增強BSEP的功能，加速膽汁排泄，從而減緩膽汁淤積。

綜上所述，本文主要研究了RFP和TAN ⅡA對BSEP轉運能力的影響，結果表明，RFP能夠抑制BSEP的轉運能力，TAN ⅡA與RFP聯用后，BSEP的轉運能力上調。本研究進一步闡明了RFP誘導膽汁淤積的分子機制，為臨床治療RFP誘導的膽汁淤積提供了新的靶點，同時為TAN ⅡA用于預防RFP所致的膽汁淤積提供了依據。