Urocortin對糖尿病心肌病的保護作用與Akt/GSK-3β信號通路的關系

劉新宇，劉春娜，李思璇，鄭 晨，劉婉珠

(錦州醫科大學1. 附屬第一醫院內分泌科、2. 基礎醫學院藥理學教研室，遼寧 錦州 121001)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最為常見和嚴重的慢性并發癥之一，其發病率與DM的病程高度相關。大量的研究發現，病史5年的DM患者，其DCM的發生率約為44.4%，8年升高至56%。并且DCM目前已經成為DM患者的主要致死原因之一[1]。研究發現，在長期處于高糖狀態下，DM患者的心肌細胞內的糖、脂及蛋白質代謝發生紊亂，進而引起心肌細胞、血管內皮等組織的損傷，最終導致心肌細胞肥大、壞死、心肌間質纖維化等病理學改變[2]。DCM的發病機制目前仍尚不明確，但新近的研究發現，炎性細胞因子轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)和結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)可能在DCM發生及發展中起著重要作用[3]。因此，尋求DCM的治療藥物，已經成為目前研究的熱點。然而，國內外尚無安全有效的治療藥物。

研究發現，內分泌-血管活性肽Urocortin(UCN)在多種心血管疾病中發揮治療和保護作用。UCN是廣泛分布于下丘腦、垂體及多種外周器官的神經內分泌活性肽[4]。UCN通過自分泌或旁分泌作用，具有多種生理及藥理作用。業已證明，UCN能降低自發性高血壓大鼠的血壓，具有類似鈣通道阻斷劑的擴張冠脈血管的作用，并在動脈粥樣硬化和心肌缺血/再灌注損傷中發揮重要作用。新近研究也提示，UCN可能在DCM中同樣發揮保護作用，能降血壓，并且能預防或逆轉心肌的病理性重構[5]，但具體作用及機制未見報道。因此，本研究采用DCM大鼠，探討UCN對DCM大鼠心肌細胞內炎性細胞因子，如TGF-β1和CTGF水平的影響，進一步探討UCN對DCM保護作用與蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β(Akt/GSK-3β)信號通路的關系，為UCN成為DCM有效治療藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 ♂健康Wistar大鼠，50只，體質量(250～300) g，18～20周齡，由上海實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(遼) 2007-0009。飼養條件：溫度(20～24) ℃，濕度45%±5%，有充分光照及通風條件，大鼠每籠10只。

1.1.2藥物與試劑 Urocortin、Astressin、Triciribine，均購自美國Sigma公司；鏈脲佐菌素，購自北京博愛港商貿中心；TGF-β1單克隆抗體、p-Akt(Ser473)、Akt、p-GSK-3β(Ser9)、GSK-3β抗體，均購自武漢博士得生物工程有限公司；兔抗鼠CTGF單克隆抗體，購自碧云天生物試劑公司。

1.1.3儀器 AccuCheck血糖檢測儀(德國羅氏公司)；IX70型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；LEICA-RM2135石蠟切片機(德國萊卡公司)。

1.2 動物造模及實驗分組選取40只Wistar大鼠，尾靜脈注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)55 mg·kg-1(溶于新鮮配制的0.1 mol·L-1，pH 4.3的檸檬酸鈉緩沖液中)，連續給藥3 d，誘導DM模型建立。以空腹血糖≥16.7 mmol·L-1，尿糖++++，有多飲、多食、多尿癥狀的大鼠視為DM大鼠造模成功，每周監測尿糖、血糖以及體質量變化。將實驗動物隨機分為5組，每組10只大鼠，包括：①空白對照組(Control)，Wistar大鼠給予生理鹽水1 mL·kg-1·d-1；②DCM組，DM大鼠給予生理鹽水1 mL·kg-1·d-1；③UCN組，DM大鼠給予UCN 10 μg·kg-1·d-1；④UCN與Astressin(CRH-R2阻斷劑)組(UCN+AST)，DM大鼠給予UCN 10 μg·kg-1·d-1和Astressin 30 μg·kg-1·d-1；⑤UCN與Triciribine(Akt阻斷劑)組(UCN+TRI)，DM大鼠給予UCN 7 μg·kg-1·d-1和Triciribine 0.5 mg·kg-1·d-1。上述各組實驗動物均飼養12周后給藥，給藥途徑為腹腔注射，持續給藥4周。

1.3 大鼠一般狀態、體質量及血糖、尿糖的觀察實驗期間均不禁食，自由活動，予以充足水及食物。各組實驗動物在16周后，用代謝籠收集各組大鼠當日尿量，測定尿糖。每2周測定各組大鼠體質量變化和尾靜脈采血監測血糖。

1.4 ELISA法測定血清中TGF-β1和CTGF的水平16周后，20%烏拉坦(1 g·kg-1)麻醉大鼠，成功后每只頸動脈取血2 mL，分別置于EP管中，3 500 r·min-1離心5 min，取上清。ELISA法測血清TGF-β1和CTGF水平。

1.5 大鼠心肌細胞形態學觀察血清TGF-β1和CTGF水平測定結束后，將各組實驗動物手術打開胸腔，取出心臟，制備心肌組織石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察大鼠心肌病理學改變，以確定DCM模型成功。

1.6 Western blot法測定心肌組織TGF-β1、CTGF、Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β的蛋白表達將每組心肌組織(保存于-80 ℃)各取100 mg，置于5個EP管中，每個EP管各加入裂解液200 μL。剪碎心肌組織后超聲粉碎，12 000 r·min-1離心30 min后取上清。應用牛血清白蛋白作為對照，計算各組蛋白含量。上樣后，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法將蛋白質轉移至PVDF膜，封閉2 h后，置于一抗中4 ℃孵育過夜。次日TBS沖洗3次(每次4 min)，置于辣根過氧化物酶標記的二抗中，室溫孵育1 h，TBS洗膜3次(每次4 min)，將膜置于顯色劑中，避光顯色3～5 min后拍片，自動分析凝膠圖像的軟件計算蛋白量。

2 結果

2.1 血糖、尿糖及體質量的改變Tab 1結果顯示，Control組大鼠血糖(blood glucose，BG)波動在3～6 mmol·L-1之間，尿糖(urinary glucose，UG)陰性(-)。DM大鼠成模后，血糖均超過16.5 mmol·L-1，24 h尿量(urine volume，UV)增多，尿糖均+以上。各組DM大鼠體質量(body weight，BW)均明顯下降(P<0.01)。與DCM組相比，UCN組大鼠體質量增加，差異具有顯著性(P<0.01)。UCN組大鼠血糖和尿糖雖高于Control組，但與DCM組相比，尿糖有所降低(P<0.05)。UCN組及各實驗組血糖與DCM組相比，沒有明顯下降。

Tab 1 Influences of UCN on blood glucose, urine glucose, urine volume, body weight in DCM

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsDCM

2.2 UCN對血清TGF-β1和CTGF的影響如Fig 1所示，與Control組相比，其它各組大鼠血清TGF-β1和CTGF水平均明顯升高(P<0.05)；與DCM組相比，UCN組大鼠血清TGF-β1和CTGF水平明顯下降(P<0.05)。UCN+AST組大鼠血清TGF-β1、CTGF水平與DCM組相比，差異無顯著性(P>0.05)。

2.3 UCN對大鼠心肌組織病理形態的影響如Fig 2所示，Control組大鼠心肌細胞形態正常，間質未見明顯改變；DCM組大鼠心肌細胞肥大、變性、心肌膠原纖維排列紊亂、炎性細胞浸潤，出現壞死，符合DCM病理改變；與DCM組相比，UCN組大鼠心肌病理損傷明顯減輕，細胞排列較整齊，有少量炎性細胞浸潤；與UCN組相比，UCN+AST和UCN+TRI組大鼠心肌細胞損傷較為明顯，心肌細胞肥大，膠原增生、細胞排列紊亂。

Fig 1 Effects of UCN on TGF-β1 and CTGF in plasma

*P<0.05, **P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDCM;△P<0.05vsUCN

Fig 2 Effects of UCN on pathological morphology of myocardial tissue in rats(HE staining×100)

A: Control group; B: DCM group; C: UCN group; D: UCN+Astressin group; E: UCN+Triciribine group.

2.4 UCN對心肌組織TGF-β1和CTGF表達的影響如Fig 3所示，與Control組相比，DCM組大鼠心肌組織TGF-β1和CTGF表達水平明顯升高(P<0.01)；與DCM組相比，UCN組大鼠心肌組織TGF-β1和CTGF的表達水平明顯下降(P<0.05)；與DCM組相比，UCN+AST組大鼠心肌組織TGF-β1和CTGF表達水平差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 3 Effects of UCN on TGF-β1 and CTGF expression

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDCM;△P<0.05vsUCN

2.5 UCN對心肌組織Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表達的影響如Fig 4所示，與Control組相比，DCM組大鼠心肌組織p-Akt和p-GSK-3β表達水平明顯降低(P<0.01)；與DCM組相比，UCN組大鼠心肌組織p-Akt和p-GSK-3β的表達水平明顯升高(P<0.05)。UCN+AST組大鼠心肌組織p-Akt和p-GSK-3β表達水平與DCM組相比，差異無顯著性(P>0.05)。

3 討論

本實驗中，DM大鼠飼養16周后，三多一少癥狀明顯，死亡鼠增加，出現白內障、失明等情況，表明DM大鼠出現微血管并發癥，提示DM大鼠可能發生DCM病變。HE染色顯示：DM大鼠心肌細胞肥大壞死，心肌肌原纖維不規則排列，出現炎性細胞浸潤，成功制備DCM模型。DCM是獨立的心臟病變，其發病機制可能包括物質能量代謝障礙、心肌間質纖維化、心臟副交感神經調節受損及心臟微小血管病變等。DCM尚無有效的防治方法，控制血糖、血壓、血脂及改善心臟功能是目前主要的治療原則。

在實驗中，我們發現DCM組大鼠血清及心肌組織中TGF-β1和CTGF水平明顯升高，UCN能明顯降低DCM組大鼠血清及心肌組織中的TGF-β1和CTGF水平。CTGF是一種由349個氨基酸組成的富含半胱氨酸的肝素結合肽，目前已證明，心臟、肺臟、肝臟、腎臟和結締組織中廣泛地存在CTGF的表達[6]。多種臟器的纖維化與CTGF在該臟器的高表達密切相關，并能觸發與纖維化有關的，如細胞增殖、黏附、遷移和細胞外基質合成等細胞變化，長期過度表達能明顯促進纖維化的發生和發展[7]。多種細胞因子可以調控CTGF的表達，其中TGF-β1是誘導CTGF表達的最為重要的因素之一[8]。TGF-β1對細胞生長分化、細胞外基質沉積具有潛在作用，是體內最有力的促纖維化生長因子之一，是促進肺臟、肝臟、腎臟等多種臟器纖維化的關鍵因子之一[9]。TGF-β1反應元件存在于CTGF基因啟動子序列中，調控成纖維細胞中CTGF的表達[10]。在DCM發生、發展中，TGF-β1和CTGF起著非常重要的作用[11]。活化的TGF-β1促進纖維細胞合成膠原纖維、纖維黏連蛋白和蛋白多糖，加劇組織纖維化；活化的TGF-β1還能誘導蛋白水解酶抑制物的合成，抑制蛋白水解酶的表達，并且抑制纖溶酶原、膠原酶、基質酶酶原激活物的產生。DM大鼠心室肌細胞CTGF表達明顯增加，并隨病程持續升高，細胞外基質蛋白合成加速，成纖維細胞合成膠原蛋白增加，心肌細胞肥大[12]。肥厚和纖維化的心肌組織中TGF-β1表達明顯增多，其可促進心肌細胞肥大，刺激成纖維細胞分泌膠原增多，促進細胞外基質的合成，抑制其降解[3]。本實驗發現，與DCM組相比，UCN組大鼠血清及心肌組織中的TGF-β1和CTGF水平明顯下降，提示UCN可通過降低DCM大鼠TGF-β1和CTGF水平，抑制致心肌纖維化的重要炎癥因子的生成，最終對DCM起治療作用。

Fig 4 Effects of UCN on p-Akt/Akt and p-GSK-3β/GSK-3β

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDCM

實驗中發現，DCM組大鼠心肌組織p-Akt和p-GSK-3β表達水平明顯降低，給予UCN后，p-Akt和p-GSK-3β的表達水平明顯升高。Akt是磷脂酸肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)下游的重要信號分子，參與調節細胞的分裂、分化、生長、代謝以及凋亡等一系列生理及病理過程[13]。GSK-3β是Akt重要的下游底物之一，活化的Akt能與GSK-3β結合，誘導GSK-3β向細胞膜轉位，磷酸化其N端的Ser9活性位點，并使之失活[14]。Akt/GSK-3β通路受損與胰島素抵抗相關性疾病，如2型DM、糖尿病腎病、心血管疾病等密切相關[15]。在本實驗中，DCM大鼠心肌細胞p-Akt和p-GSK-3β表達明顯降低，表明Akt/GSK-3β信號通路參與了DCM的發生、發展，UCN能明顯增強DCM大鼠心肌組織p-Akt和p-GSK-3β的表達，提示UCN對DCM的保護及治療作用與Akt/GSK-3β信號通路關系密切。

在實驗中，我們發現UCN能明顯抑制DM大鼠心肌細胞TGF-β1和CTGF的表達，激活Akt/GSK-3β信號途徑。此外，UCN對高血糖導致的心肌損害的保護作用能被CRH-R2阻斷劑(Astressin)所抑制，Akt阻斷劑(Triciribine)也部分抑制UCN對DCM的作用，UCN促Akt和GSK-3β磷酸化的作用也被Astressin抑制。UCN主要與CRH-R結合后發揮生物學作用[16]。UCN具有強大的心血管保護作用，能抑制心肌缺血/再灌注所導致的心肌細胞凋亡；擴張冠狀動脈，保證心肌自身的血液供應，逆轉心肌缺血導致的心肌壞死[17]。以上結果提示，UCN對DCM心肌的保護作用可能通過CRH-R2介導激活Akt/GSK-3β信號通路實現的。

綜上所述，UCN對DCM具有保護作用，其機制可能與UCN磷酸化Akt和GSK-3β，激活Akt/GSK-3β信號通路，抑制TGF-β1和CTGF的表達有關，但具體機制仍有待進一步的探究。