Krupple樣因子6及誘導型一氧化氮合酶在銅綠假單胞菌上清液感染RAW264.7凋亡過程中的表達

劉夢茹，王雅琪，張 偉，姚富榮，蒼 林， 柴文戍

(1. 錦州醫科大學附屬第一醫院呼吸內科，遼寧 錦州 121000；2. 青島大學附屬醫院檢驗科，山東 青島 266000；3.錦州醫科大學，遼寧 錦州 121001)

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是院內感染最常見的一種革蘭陰性機會致病菌，易感人群主要為肺囊性纖維化[1]、慢性阻塞性肺疾病[2]、腫瘤[3]、獲得性免疫缺陷癥等免疫力低下的患者。近年來，PA已經成為醫院感染高患病率和致死率最常見的致病因子之一，且耐藥率呈逐年上升的趨勢。本實驗選取PA作為研究對象，意圖探明其對免疫細胞的作用機制，從而為治療其感染尋找新的靶點。

來自于單核細胞的巨噬細胞是被招募到炎癥部位的主要先天免疫細胞。在機體發生感染導致局部炎癥產生后，這些被招募到炎癥部位的巨噬細胞在炎癥的發生、擴散和消退過程中起著關鍵作用，巨噬細胞增殖能力降低，減弱了巨噬細胞吞噬病原體的能力，造成持續感染，損傷肺組織[4]。巨噬細胞的增殖與凋亡在感染過程中發揮著重要的作用，因此，探討PA上清液對巨噬細胞增殖抑制、凋亡的影響是控制PA感染機體的關鍵。

Krupple樣因子6(Krupple-like factor 6，KLF6)是Kruppel樣C2H2鋅指轉錄因子家族的成員，參與多種細胞增殖、凋亡等過程[5]。KLF6在炎癥反應的基因表達調控中發揮重要作用，有報道表明，KLF6與誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)之間是有作用聯系的。iNOS通常不在細胞中表達，在巨噬細胞中，通常是由一些病原體或者細胞因子刺激，誘導iNOS合成并產生一氧化氮(NO)，破壞細胞穩定，發揮細胞毒性作用，促進細胞凋亡，也可導致周圍組織損傷[6-7]。我們前期研究發現，PA可誘導肺組織細胞中KLF6的表達，并可能通過調控iNOS，介導肺組織細胞凋亡[8]。本實驗以小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7為研究對象，探討PA上清液對RAW264.7凋亡的影響，同時檢測KLF6及iNOS在此過程中的表達情況。

1 材料

1.1 細胞株與菌株RAW264.7細胞，北部戰區總醫院心血管病研究所贈予。PA為標準菌株ATCC27853，來自錦州醫科大學微生物實驗室。

1.2 試劑DMEM培養基(Gibco)；胎牛血清(PAN)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；MTT、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(北京索萊寶科技有限公司); Hoechst 33342染色液(萬類生物科技有限公司)。

1.3 儀器流式細胞儀、成像儀(美國BD Biosciences公司)；半干轉儀(美國Bio-Rad公司)；高速冷凍離心機(德國Thermo Fisher公司)。

2 方法

2.1 細胞培養與傳代RAW264.7細胞在含10%胎牛血清的DMEM中，5% CO2、37 ℃條件下進行培養，每1～2 d半量更換培養基。細胞生長至80%融合時，按1 ∶5傳代培養。

2.2 菌株、細菌培養及細菌上清液的制備將細菌株復蘇后，取血瓊脂平板上單個PA菌落，接種于8 mL的大豆肉湯培養基中，通過振顫法(37 ℃，8 h)對PA進行增菌，獲取OD600=1的濃度的菌液，然后1 600×g離心15 min，獲得上清液，用孔徑0.22 μm的濾膜過濾，最后滅活(56 ℃、1 h),儲存在-20 ℃備用。

2.3 MTT檢測RAW264.7細胞增殖將RAW264.7細胞按照13 000個/孔接種到96孔板中，培養過夜。24 h后，分為陰性對照組(只加細胞)、PA上清感染組(體積比為0.15、0.3、0.45的PA上清液與培養基的混合液)，每組6個復孔，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養，分別培養6、12、24 h后，每孔加入20 μL MTT染色液，在細胞培養箱內繼續孵育4 h。吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，酶標儀在560 nm測定每孔的吸光度值，實驗重復3次。細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/陰性對照組OD值)×100%。

2.4 Hoechst 33342染色RAW264.7細胞以1.8×105個/孔接種于12孔板中，置37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養24 h后，分別加入體積比為0.15、0.30、0.45的PA上清液與培養基的混合液，以24 h為檢測點，吸盡培養液，加入300 μL固定液固定15 min，PBS洗5 min，加入300 μL Hoechst 33342染液，室溫孵育15 min，PBS洗滌3遍，每次5 min。隨后在Cytation3細胞成像多功能檢測儀20×微米級分辨率，觀察凋亡細胞核形態。

2.5 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測RAW 264.7細胞凋亡取對數生長期細胞，按2×105個/孔接種于6孔板，置37 ℃、5% CO2培養過夜，按濃度梯度加入PA上清液，對照組為正常培養的細胞，24 h為檢測點。離心收集細胞，用預冷PBS洗滌1次，加入Binding buffer 100 μL重懸細胞，每管加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，避光室溫反應10～15 min。檢測前，加入10 μL PI staining solution，1 h內檢測完畢。

2.6 Western blot檢測KLF6及iNOS的表達細胞培養、分組和干預同“2.5”，另設體積比為0.3的PA上清液與培養基混合液，分別作用12、24 h，收集細胞，加入裂解液，冰上充分裂解，提取總蛋白。按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明進行蛋白濃度測定，10% SDS-PAGE分離蛋白，用電轉儀半干法轉至硝酸纖維素膜上。加入1 ∶1 000稀釋的β-actin一抗，1 ∶500稀釋的KLF6一抗，1 ∶1 000稀釋的iNOS一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，再加入1 ∶10 000稀釋的二抗孵育1.5 h。最后滴入超敏ECL顯影并曝光。以目的蛋白與內參β-actin蛋白的條帶灰度值之比表示各蛋白的相對表達水平，實驗重復3次。

3 結果

3.1 PA上清液對RAW24.7細胞增殖的抑制作用Fig 1的MTT結果顯示，在12、24 h時，與對照組相比，PA上清液組細胞增殖抑制率均明顯增加(P<0.01)。不同濃度上清液組之間比較，細胞增殖抑制率隨著濃度的增加而增加(P<0.01)。24 h不同濃度上清液組組與12 h組比較，細胞增殖抑制率隨著時間的延長而增加(P<0.01)。說明PA上清液能明顯抑制RAW264.7細胞的增殖，抑制效應呈濃度-時間依賴關系。

Fig 1 Effect of PA supernatant on proliferation inhibitory rate of RAW 264.7 n=3)

**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vs0.15 group;▲▲P<0.01vs0.3 group;##P<0.01vs12 h group

3.2 PA作用RAW264.7細胞后的形態學變化經Hoechst 33342染色后，對照組RAW264.7細胞的細胞核呈藍色圓形或橢圓形，染色體均勻一致；經不同體積濃度比的PA上清液處理RAW264.7細胞24 h后，細胞核固縮，深染，核內可見濃染致密的塊狀顆粒，這些細胞核形態變化均為細胞凋亡的表現，其中以0.45的PA上清液處理組最為明顯，見Fig 2。

Fig 2 Effect of PA supernant on Cytation3 cell imaging multi-function detector of RAW264.7

A: Control；B: 0.15；C: 0.3；D: 0.45. Red arrow refers to apoptotic cells

3.3 PA誘導RAW264.7細胞凋亡Fig 3的流式細胞儀檢測結果顯示，RAW264.7細胞與不同濃度的PA上清液作用24 h后，與對照組相比，RAW264.7細胞的凋亡率隨著PA上清液濃度的增高而增加(P<0.05)，0.3濃度PA上清液組與0.15濃度PA上清液組比較，細胞凋亡率有明顯增加(P<0.01)。與0.15、0.3濃度PA上清液組比較，0.45濃度PA上清液組細胞凋亡率均有明顯增加(P<0.01)。提示PA上清液增加RAW264.7細胞凋亡比例呈濃度依賴性。

3.4 PA上清液促進RAW264.7細胞KLF6及iNOS的表達如Fig 4所示，與對照組相比，PA上清液組能夠以濃度依賴性的方式增加KLF6蛋白表達(P<0.05)，同時iNOS表達增加(P<0.01)；與0.15濃度PA上清液組比較，0.3濃度PA上清液組KLF6表達增加(P<0.05)，iNOS表達增加(P<0.01)；與0.15、0.3濃度PA上清液組比較，0.45濃度PA上清液組KLF6表達增加(P<0.05)，iNOS表達增加(P<0.01)；尤以0.45濃度PA上清液組變化明顯。如Fig 5所示，0.3濃度PA上清液組分別作用12、24 h后，與對照組相比，12 h組、24 h組KLF6、iNOS表達水平均明顯增加(P<0.05，P<0.01)，24 h組與12 h組比較，KLF6及iNOS表達增加，差異有統計學意義(P<0.01，P<0.05)；以24 h實驗組變化更為明顯。

Fig 3 Effect of PA supernatant on apoptosis

*P<0.05vscontrol;△△P<0.01vs0.15 group;▲▲P<0.01vs0.3 group

4 討論

PA是引起院內感染致死率較高的最主要病原體之一，PA的毒力因子能夠抵消宿主防御，并且能對宿主組織造成直接損害或提高細菌的競爭力，誘導多種免疫細胞凋亡，導致機體發生急、慢性感染。

Fig 4 KLF6 and iNOS protein expression in RAW264.7 cells treated with different volume concentrations

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vs0.15 group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vs0.3 group

Fig 5 KLF6 and iNOS protein expression at different time in RAW264.7 cells treated with PA n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vs12 h group

加之近年來，由于PA對越來越多的抗生素產生耐藥性，因此，研究PA對免疫細胞的作用機制對PA感染的治療有重要作用。本研究結果顯示，PA上清液能夠明顯抑制RAW264.7細胞的增殖，說明PA的致病機制可能是通過抑制機體的免疫細胞，從而抑制了機體的免疫反應，導致機體或局部的炎癥反應持續存在，遷延不愈。

迄今為止，關于PA誘導細胞凋亡的分子機制有了廣泛的研究。3種主流的細胞凋亡誘導途徑相關的凋亡相關基因主要包括Fas配體(FasL)、Bax和Bcl-2。其中，FasL是一種能夠與死亡受體Fas結合，并介導細胞毒性誘導的細胞凋亡的配體[9]。Bcl-2能夠抑制細胞凋亡，然而，Bcl-2也通過線粒體途徑誘導細胞凋亡[10]。Bax抑制Bcl-2活性，并拮抗其抗細胞凋亡作用[11]。但目前關于KLF6和iNOS在PA對巨噬細胞凋亡方面的研究甚少。

近年來，對于KLF6在炎癥調節方面的作用研究較多。例如KLF6能夠直接與iNOS啟動子形成KLF6-DNA復合物，調控iNOS表達釋放NO，破壞細胞的穩定性，發揮細胞毒作用，參與病毒感染誘導的炎癥反應，下調上皮細胞中KLF6基因的表達后，iNOS表達減少，NO活性降低，減輕了氣道高反應，并延緩了炎癥的發展[12]。早在1994年，Kamijo等[13]就已經證實，巨噬細胞可通過iNOS表達的增加，激活NO的釋放。Mgbemena等[12]及王春波等[14]的研究表明，iNOS可轉錄生成NO，促進細胞凋亡。由此推測，本實驗結果中，KLF6和iNOS的表達水平同時增加是由于PA誘導增加了KLF6的表達，而iNOS表達的上調是由KLF6誘導的，同時，iNOS能夠促進NO釋放，從而參與細胞凋亡。這一途徑形成了單核巨噬細胞生長抑制和細胞毒性作用的基礎，促進巨噬細胞凋亡。

綜上所述，PA上清液抑制了RAW264.7細胞增殖，誘導細胞凋亡，可能是由于PA刺激KLF6表達的增加，從而調控iNOS的表達，激活NO的釋放，促進細胞凋亡。KLF6和iNOS可能共同參與了PA上清液誘導的RAW264.7細胞凋亡。然而，iNOS的表達是否依賴于KLF6的誘發，KLF6在PA上清液誘導RAW264.7細胞凋亡過程中是否起決定性作用，還有待于進一步研究。本研究為減輕PA感染引起的炎癥反應提供了新的理論依據和研究方向。

(致謝：本實驗在遼寧省錦州醫科大學附屬第一醫院轉化醫學研究院完成，感謝各位老師和同學對實驗的指導與幫助！)