基于雌激素代謝調控的白藜蘆醇對MNNG誘導子宮內膜癌變的抑制作用

尹 弟，陳春霞，閔夢君，趙 峰，杜 蕾，印曉星，周雪妍

(徐州醫科大學藥學院，江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004)

子宮內膜癌(endometrial cancer，EC)是最常見的婦科腫瘤之一，近年來，EC的發病率逐年增加，而且發病年齡愈發年輕化[1]。雖然手術結合放療和化療可以達到良好的治療效果，但是術后生育功能的喪失，以及化療藥物毒性大、副作用強、易產生耐藥性，對EC患者的身心健康構成嚴重威脅[2]。目前，EC的診斷尚缺乏金標準。因此，臨床上迫切需要早期準確的EC診斷方法。

EC的發生發展與體內雌激素水平密切相關[3]。雌激素活性物質包括雌酮(estrone，E1)、雌二醇(estradiol，E2)、雌三醇(estriol，E3)、2-羥基雌酮/雌二醇(2-hydroxyestrone/estradiol，2-OHE1/E2)、4-羥基雌酮/雌二醇(4-hydroxyestrone/estradiol，4-OHE1/E2)、16α-羥基雌酮(16α-hydroxyestrone，16α-OHE1)、2-甲氧基雌酮/雌二醇(2-methoxyestrone/estradiol，2-MeOE1/E2)和4-甲氧基雌酮/雌二醇(4-methoxy-estrone/estradiol，4-MeOE1/E2)。超生理濃度的雌激素可與雌激素受體結合，介導多種生長因子的過表達，促進細胞的生長和增殖[4]。而雌激素的多種代謝產物則可與DNA形成加合物，誘導基因突變，產生直接的基因毒性。尤其是2-OHE2和4-OHE2具有極強的致癌活性，它們在體內通過非受體介導，與DNA形成加和物，導致DNA編碼錯誤，誘導DNA損傷，促進癌癥形成[5]。因此，雌激素及其毒性代謝產物異常蓄積，是EC發生發展的重要危險因素。

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種植物多酚，具有抗氧化、抗腫瘤效應[6]。研究發現，Res可以抑制成年乳腺癌♀鼠的腫瘤發生，但對于青春期前的未成年♀鼠，Res則延長了實驗動物的動情期時間，并增加了乳腺癌的發病率和平均瘤重[7]。因此，Res對腫瘤的調控作用與實驗對象體內雌激素水平密切相關。本實驗以ICR ♀小鼠為研究對象，通過宮腔注射N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl- N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)建立小鼠EC模型，同時給予Res進行治療，考察Res對雌激素內穩態的調控及EC的治療作用，為探尋EC臨床診斷潛在生物標志物與EC的臨床藥物治療方案提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級ICR小鼠，♀，體質量(16～20) g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。飼養于徐州醫科大學新藥與臨床藥學重點實驗室清潔級動物實驗室，許可證號：SCXK(滬)2013-0016，室溫(25±2)℃，相對濕度(55±5)%，光暗周期12 h/12 h。實驗期間各組小鼠給予自由飲水。

1.2 試劑MNNG(貨號R-081N)、Res(貨號M02442)，購自北京百靈威科技有限公司；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(C0105)，購自碧云天生物技術研究所；TRNAiso Plus(貨號9108)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(貨號RR820A)、PrimeScript RT reagent Kit(貨號RR037A)，購自寶生物工程(大連)有限公司；雌二醇(貨號E8875)、雌酮(貨號1238002)，購自美國Sigma Aldrich公司；2-甲氧基雌二醇(貨號E2490-000)、4-羥基雌二醇(貨號E2500-000)、2-羥基雌二醇(貨號E2470-000)、16α-羥基雌酮(貨號E1250-000)，購自加拿大Steraloids公司；4-甲氧基雌二醇(貨號M262630)、2-羥基雌酮(貨號H941945)、4-羥基雌酮(貨號H941950)、2-甲氧基雌酮(貨號M262520)、4-甲氧基雌酮(貨號M226135)，購自北京百靈威科技有限公司；d5-雌二醇(貨號D-5552)，購自美國C/D/N同位素公司。

1.3 儀器KD-TS3A生物組織自動脫水機、KD-BM生物組織石蠟包埋機(金華科迪儀器設備有限公司)；RM2235輪轉式切片機、HI1210病理組織漂烘機(德國Leica公司)；Tecnai G2透射電子顯微鏡(美國FEI公司)；NanoDrop 1000核酸濃度測定儀(美國Thermo Scientific公司)；2720 PCR儀(美國ABI公司)；Light Cycle 480實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 6420A三重四級桿質譜儀、MassHunter Acquisition數據采集軟件、MassHunter Qualitative定性分析軟件和MassHunter Quantitative定量分析軟件(美國Agilent公司)。

1.4 EC小鼠模型的建立♀ ICR小鼠(4～5周齡)，適應1周后，將小鼠隨機分為4組，每組10只：正常對照組(Control組)、Res組、模型組(MNNG組)、模型+Res給藥組(MNNG+Res組)。其中，MNNG組和MNNG+Res組宮腔給予MNNG(溶于50%聚乙二醇中，單次給藥60 mg·kg-1)，1周1次，連續3周。對照組及Res組宮腔給予50%聚乙二醇進行假手術(給藥體積及次數同模型組)。第1次造模后，對照組及MNNG組給予空白純化日糧配方飼料飼養；Res組及MNNG+Res組給予含有Res(800 mg·kg-1)的純化日糧配方飼料飼養。具體的做法為：每天每10只小鼠給予50 g含藥飼料，每天上午8 ∶00定時更換，且將前1 d剩余的飼料倒掉，含藥飼料密閉儲存于4 ℃，避光保存。連續喂養36周后，處死小鼠并取血清、子宮組織備測。

1.5 HE染色取子宮組織，依次行4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片處理后，進行脫蠟、染色、脫水、封片，晾干后，通過顯微鏡觀察子宮組織形態結構的改變。

1.6 qPCR檢測使用TRIzol提取子宮組織總RNA，按照PrimeScript RT試劑盒說明書將RNA逆轉錄成cDNA。然后進行定量逆轉錄酶PCR分析，使用Roche LightCycle 480軟件計算得出樣本中各目的基因的Ct值，通過ΔΔCt法計算各目的基因的mRNA相對表達水平，以GADPH的mRNA表達水平作參比。引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成，序列見Tab 1。

1.7 雌激素及其代謝產物的含量測定取小鼠子宮適量，精密稱重，按100 g·L-1的比例加入PBS緩沖液，在冰水浴中充分勻漿，制備成100 g·L-1的組織勻漿液。取勻漿液或小鼠血清300 μL,加入10 μL d5-E2溶液(50 nmol·L-1)作為內標，渦旋1 min后，按照1 ∶3(V∶V)的體積加入乙酸乙酯，渦旋10 min，于4 ℃、13 000 r·min-1離心5 min，收集上層有機相，有機相于40 ℃真空冷凍干燥機旋轉干燥后，精密加入0.1 mol·L-1的Na2CO3/NaHCO3緩沖溶液(pH 9.0)50 μL和1 g·L-1的丹磺酰氯丙酮溶液50 μL，充分渦旋混合1 min，65 ℃烘箱加熱反應7 min，放冷后，4 ℃、13 000 r·min-1離心15 min，轉移上清液入進樣瓶中。用LC-MS/MS法測定樣本中雌激素及其代謝產物共11種目標分析物的含量，檢測方法應用本課題組前期建立并驗證的液質聯用方法檢測[8]；定量方法采用加內標的標準工作曲線法。

Tab 1 qPCR reaction primers and amplification length

2 結果

2.1 Res對EC發生發展的抑制作用Fig 1A結果顯示，MNNG組小鼠的體質量呈逐漸增加的趨勢，于第4周和第8周體質量明顯高于對照組(P<0.05)；MNNG+Res組小鼠體質量均較MNNG組小鼠低，且于16～36周體質量明顯低于MNNG組(P<0.01)。同時子宮指數結果顯示，MNNG組小鼠子宮指數比對照組高，且差異有統計學意義(P<0.05)。給予Res治療后，MNNG+Res組小鼠子宮指數有所減小，且差異有統計學意義(P<0.05)，見Fig 1B。qPCR方法檢測各腫瘤標志物的mRNA表達水平(Fig 1C)，與對照組相比，模型組中Ccnd1、Erbb2的mRNA表達明顯升高(P<0.01)，且給予Res治療后，其表達明顯降低(P<0.01)；CK-19在模型組和正常對照組之間無統計學差異，但其在MNNG+Res組的表達明顯降低(P<0.01)。小鼠子宮組織HE染色結果顯示(Fig 1D)，對照組和Res組小鼠子宮內膜腺體排列規則，結構良好；而MNNG誘導的EC小鼠的HE染色結果顯示子宮內膜腺體結構復雜、排列緊密，部分間質消失，腺腔可見分支形成，局灶可見篩孔；給予Res治療后，小鼠子宮肌層輕度水腫，子宮內膜較模型組趨于正常狀態。

2.2 Res對雌激素內穩態的調控作用采用LC-MS/MS定量分析方法檢測小鼠血清和子宮組織中雌激素及其代謝產物的含量，并將數據采用SIMCA 14.0軟件進行OPLS-DA統計分析。采用VIP來衡量預測各個代謝物對模型的貢獻，通常VIP>1為潛在生物標志物的評判標準。同時需要進一步通過t檢驗方法，保留具有統計學差異的數據。

對模型分離貢獻作用較大且差異具有統計學意義的代謝物有：血清中，4-MeOE1、E1；子宮中，4-OHE2、2-MeOE1，表明這幾個代謝物可能是Res抗腫瘤作用的潛在生物標志物。

對上述代謝物分別進行含量測定，Tab 2結果顯示，在EC小鼠血清及子宮內膜組織中，具有細胞保護效應的2-MeOE2、4-MeOE1含量明顯降低，具有基因毒性作用的4-OHE2含量明顯升高，而給予Res治療后可恢復其穩態平衡。提示Res可能通過調控雌激素內穩態，發揮其對EC的抑制作用。

3 討論

EC是最常見的婦科惡性腫瘤，在我國，隨著社會發展和經濟條件改善，EC的發病率逐年升高，目前僅次于宮頸癌，居女性生殖系統惡性腫瘤的第2位。初潮年齡早及晚絕經、多囊卵巢綜合征、外源性雌激素作用、子宮內膜癌三聯征(肥胖-高血壓-糖尿病)、乳腺癌、卵巢癌家族史等，均為EC的高危因素，嚴重危害著女性的生命健康。雖然手術聯合放化療的治療方案可取得良好的治療效果，但是，術后生育功能的喪失以及保守治療所帶來的復發風險仍給EC患者的生理、心理健康帶來了嚴重的威脅[2]。

Fig 1 Inhibition of resveratrol on endometrial cancer model

A:Body weight curves were plotted for each treatment group; B: Mice uterus index; C:The mRNA expression of Ccnd1, Erbb2 and CK-19 was detected in uterus tissues; D:HE staining of uterus tissue for the appearance and structure of the tumor ×40.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsMNNG group.

Tab 2 Concentration of potential biomarkers in serum and uterine tissue of

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsMNNG

Fig 2 OPLS-DA score plots of serum(A, C) and uterus tissue(B, D) estrogen metabolites in mice

Fig 3 Variable importance in projection(VIP) values calculated from OPLS-DA models for estrogen metabolic profile data in mouse serum(A, C) and uterus tissue(B, D)

毫無疑問，EC若能盡早被發現并對其加以控制，病情將得到改善或逆轉；而若在臨床早期不對其加以控制，病情發展將難以控制。但事實上，EC的臨床診斷尚缺乏金標準，早期EC的診斷還比較困難，需要仔細詢問病史，準確細致地進行婦科檢查，并采用輔助檢查，才能進一步作出診斷。目前，臨床上對EC的診斷方法主要還是通過診斷性刮宮及分段診刮[9]，但是，診刮不能判斷是否有肌層的浸潤及浸潤的深度，是否有淋巴結轉移情況，故無法進行術前準確分期，不能達到早期、準確診斷EC的要求。因此，尋找有預測價值的EC生物標志物具有極其重要的臨床意義。本實驗通過LC-MS/MS定量分析方法，測定EC小鼠血清和子宮組織樣本中雌激素及其代謝產物的含量變化，旨在探明可用于EC臨床診斷的潛在生物標志物。

多項研究表明，雌激素代謝紊亂與婦科腫瘤疾病密切相關。雌激素類物質可在體內多種代謝酶的介導下進行動態的生物轉化，而雌激素及其毒性代謝產物組成的活性物質組則根據其結構的不同、濃度水平的差異，以不同的分子機制在EC的發生、發展過程中發揮著重要的作用。內源性雌激素主要包括E1、E2和E3，由于體內E3的含量極低，故雌激素的代謝研究主要還是考察E1和E2的代謝情況。雌激素的代謝方式包括氧化代謝與結合代謝(O-甲基化、葡萄糖醛酸化及磺化等)兩種。氧化代謝主要為羥基化過程，主要產物為4-OHE2、2-OHE2、4-OHE1、2-OHE1和16α-OHE1。雌激素的代謝紊亂被認為與婦科腫瘤相關是因為有證據表明，其可以引起DNA損傷和突變，其中雌激素的羥基化代謝起了主要作用，在雌激素的羥基化代謝產物中，4-OHE2是活性最強的一種[10]。雌激素的另一類代謝產物是由羥基化代謝產物被兒茶酚胺氧位甲基轉移酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)甲基化生成的甲氧基類雌激素(2-MeOE2、4-MeOE2、2-MeOE1、4-MeOE1)，這類雌激素表現為保護效應，且有研究表明，2-MeOE2可明顯抑制6T-CEM細胞增殖，促進細胞凋亡[5-6,11]。

Res具有抗癌、抗突變、抗炎、誘導細胞凋亡及雌激素調節等多方面的藥理活性。Res可作用于在腫瘤的起始、促進、發展3個階段：① 通過抗突變、誘導二相藥代酶的作用，發揮抗腫瘤起始活性[12]；② 通過抗炎、抑制環加氧酶和氫過氧化物酶的活性，在腫瘤的促進階段起抑制作用[13]；③ 誘導人早幼粒白血病細胞的分化而抑制腫瘤的發展[14]。Banerjee等[15]利用EC細胞系進行體外實驗發現，Res可對EC細胞發揮很好的生長抑制作用，并且能最大限度地抑制E2介導的ER陽性乳腺癌MCF-7細胞生長刺激效應。且Res是一種多酚類化合物，因其分子結構與合成的雌激素類化合物己烯雌酚的結構類似，并顯示一定的雌激素樣活性，被稱為植物雌激素。因此，Res可能通過調控雌激素水平，進而抑制EC的發生、發展。

目前，EC模型可分為大鼠自發子宮內膜腺癌、雌激素誘導子宮內膜癌、MNNG誘導子宮內膜癌、腫瘤細胞接種誘導裸鼠子宮內膜癌、Pten基因突變誘導的子宮內膜癌模型。在本實驗中，采用MNNG誘導的小鼠EC對各種激素敏感，且造模方法簡單，造模成本相對較低，重復性強。HE染色結果顯示，MNNG組小鼠腺體結構復雜、排列緊密，部分間質消失，腺腔可見分支形成，局灶可見篩孔，表明EC模型是成功的。qPCR實驗檢測小鼠子宮組織中腫瘤標志物的表達，對EC模型進行了驗證。在MNNG+Res組中，給予Res治療后，小鼠子宮內膜的形態發生了改變，內膜增生得到了改善，且腫瘤標志物的表達也明顯降低，表明Res對EC產生了一定的抑制作用。且EC小鼠體內具有保護作用的代謝產物2-MeOE2、2-MeOE1和4-MeOE1的水平明顯下降，同時其具有毒性作用的代謝產物4-OHE2的含量明顯增加；在給予Res治療后，對應的代謝產物的水平也發生了相應的逆轉，再次表明Res抑制了EC的發生發展。此外，在EC小鼠體內，2-MeOE2和4-OHE2的水平在子宮組織和外周血液中具有相似的變化趨勢。提示外周血液中的2-MeOE2和4-OHE2有可能作為EC臨床診斷的無創性生物標志物。