牛樟芝泛醌類活性成分研究進展*

衣振偉，劉曉鳳，王光強，熊智強，艾連中，夏永軍

（上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海食品微生物工程技術研究中心，上海 200093）

牛樟芝（Antrodia camphorata）是20世紀90年代在我國臺灣發現的珍稀藥用真菌，專一寄生于臺灣特有的保護樹種牛樟樹（Cinnamomum kanehirai）腐朽樹干內壁，生長極為緩慢（1年～3年），自然產量稀少，其主要培養方式如圖1所示[1,2]。近年來，許多學者研究顯示牛樟芝具有多種功能活性，含有豐富的次級代謝產物，包括三萜類化合物、泛醌類化合物、Antrodins類化合物、超氧歧化酶、多糖等[3-7]。牛樟芝不同培養方式獲得的產物有較大差異。子實體中含有豐富的三萜類化合物，尤其是具有24(28)-en側鏈特征的麥角甾烷類三萜；而菌絲體中含有的主要活性成為泛醌類化合物Antroquinonols以及馬來酸衍生物Antrodins[8]。其中以Antrquinonol為代表的泛醌類組分是極具應用潛力的活性化合物。本文從牛樟芝泛醌類組分活性、生物及化學合成等角度對其進行綜述。

圖1 不同培養方式得到的牛樟芝Fig.1 Antrodia camphorata obtained by different culture methods

1 牛樟芝泛醌類組分的發現

2007年，Lee等[9]人將固態發酵樟芝磨成粉末后用正己烷進行萃取，從中得到Antroquinonol，是牛樟芝固態發酵產物中鑒定出的第一個泛醌類化合物，分子式為C24H38O4，微黃色，屬于脂溶性苯醌，結構上與輔酶Q3相近。Yang等[10]從牛樟芝固態發酵粉末中分離出4-acetyl-Antroquinonol-B和Antroquinonol-B，皆為無色油脂化合物，分子 式 分 別 為C26H38O7及C24H36O6，Antroquinonol及Antroquinonol-B結構式相差一個五碳環，Antroquinonol-B及4-acetyl-Antroquinonol-B結構式相差一個乙酰基（acetyl）。Antroquinonol-D也是從牛樟芝固態發酵產物中分離得到，與Antroquinonol相差一個甲氧基[11]。研究結果表明牛樟芝泛醌類化合物具有顯著的抗腫瘤、抗炎等生理活性，開發價值較大，其結構如圖2所示。

圖2 牛樟芝菌絲體中的泛醌類化合物Fig.2 Ubiquinone compounds in the mycelium of Antrodia camphorata

2 牛樟芝泛醌類活性成分功能研究

2.1 抗癌活性

研究表明泛醌類組分能夠抑制多種癌細胞的增殖和遷移，目前已有文獻報道包括Hep3B、HepG2、MCF-7、MDA-MB-231、DU-145、LNCaP 等。Antroquinonol能夠下調Bcl2蛋白的表達，從而降低與之相連的P13K和mTOR蛋白水平，促進NSCLC細胞凋亡[12]。通過抑制P13K/AKT/β-catenin信號通路，Antroquinonol能夠抑制結腸癌干細胞轉移和侵染[13]。Lin等[14]研究證明，Antroquinonol能夠抑制兩種結腸癌細胞系HCT15和LoVo的增殖，兩者的G150值分別為34.8 μM和17.9 μM。此外，該研究還顯示Antroquinonol能夠抑制結腸癌細胞的侵襲和遷移且呈劑量依賴性。Lee等[15]人也有類似的發現，Antroquinonol能夠在不影響細胞活力的情況下對乳腺癌細胞侵襲和遷移具有預防作用，低濃度（2.5～10 μM）的Antroquinonol顯著降低了乳腺癌細胞系MDAMB-231的侵襲和遷移（50%～80%）。

4-acetyl-Antroquinonol-B 作用于肝癌細胞HepG2， 其 1C50 為 0.1 μg·mL-1，能夠調 節 p53、p21以及p27蛋白水平，有效抑制mTOR磷酸化，降低VEGF表達量以及RhoGTPases活性，從而抑制肝癌細胞增殖和遷移，此外還具有抗酒精性肝損傷作用[16-19]。

2.2 抗炎活性

炎癥，是機體損傷的一種防御反應，也是每天都會出現在人類生活中的一種復雜的生理反應，通常表現為發紅、腫脹和疼痛。研究發現，它與許多病理條件包括糖尿病、關節炎、心血管疾病有關。

Chang等[20]人發現，Antroquinonol具有良好的降低細胞氧化脅迫作用的活性，可以穿過血腦屏障，在阿爾茨海默病小鼠模型實驗中，能夠有效提高學習和記憶能力，降低大腦β-淀粉樣物水平，減少星形細胞增生程度。Antroquinonol也具有良好的抗炎活性，能夠有效地對抗節段硬化性腎小球腎炎（FSGS）以及通過腹腔注射沙門氏菌型LPS誘導的嚴重紅斑狼瘡腎炎，通過激活Nrf2抗氧化通路、抑制T細胞和NLRP3炎性體，顯著改善蛋白尿癥狀，從而緩解嚴重的1gA腎炎[21,22]。4-acetyl-Antroquinonol和Antroquinonol-B能強烈的抑制巨噬細胞生成NO，其 1C50 分別為 16.2 μg·L-1和 14.7 μg·L-1[23]。

2.3 保肝活性

長期的酒精攝入會引起肝臟疾病，大量科學文獻顯示過量酒精攝入會增加肝中酶類、細胞因子和趨化因子比如天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）和細胞脂質過氧化作用，這些都在酒精誘發的肝臟疾病的發病機理和進程中有重要作用[24]。另外飲酒會導致體內自由基過量產生，接著導致肝臟中還原型谷胱甘肽（GSH）含量水平的自然損耗[25]。

Kumar等[26]證明了從牛樟芝菌絲體醇提取物中得到的Antroquinonol能通過Nrf-2激活作用保護肝細胞免受乙醇誘發的氧化應激。研究發現Antroquinonol能顯著抑制由酒精誘發的AST、ALT、ROS、NO、MDA產量和人類肝癌HepG2細胞中GSH損耗。蛋白印跡和RT-PCR分析顯示Antroquinonol能通過MAPK途徑增強Nrf-2激活和下調抗氧化基因HO-1。本研究表明了Antroquinonol通過一種涉及Nrf-2激活作用和向上調控MAP激酶蛋白介導的下游抗氧化基因表達的機制來實現對肝細胞免受乙醇誘發的氧化應激的保護作用。在活體內喂食牛樟芝菌絲體醇提取物也得到了相似結果。結果表明Antroquinonol在酒精性肝病方面有治療價值。

2.4 其他活性

牛樟芝泛醌類活性成分除了在抗癌、抗炎、保肝方面表現突出，據科研人員近年來探究發現其在抗氧化、抑制腫瘤、增強免疫力等方面也具有顯著的效果。

Guan等[27]人研究了Antroquinonol作為抗氧化劑和抑制炎癥反應，評估其對CD8+T細胞的免疫抑制作用和對色素沉著的保護作用。研究發現，Antroquinonol可以抑制CD8+T細胞的增殖，減少CD8+T細胞浸潤和促炎性細胞因子分泌，并在體外抑制細胞因子1L-2和1FN-γ以及T細胞活化標記物CD69和CD137的產生，以抵抗H2O2誘導生成的脫色素。

Antroquinonol能夠降低神經膠質瘤細胞C6抗凋亡蛋白含量，同時提高促凋亡蛋白合成，進一步研究顯示，Antroquinonol的氫鍵與粘著斑激酶（FAK）的86位Arg殘基結合，抑制其酶活從而抑制腫瘤形成[28]。

Yu等[29]證明了Antroquinonol通過順序信號級聯誘導人胰腺癌AsPC-1細胞的抗癌活性。 它誘導P13-kinase/Akt活性受到抑制，進而阻斷mTOR/p70S6K/4E-BP1信號通路，導致細胞周期蛋白和Cdks的下調，翻譯抑制造成細胞周期G1停滯和線粒體依賴性細胞凋亡。上調的K-ras也可能通過與Bcl-xL的結合促成細胞凋亡。此外，自噬細胞死亡和加速衰老也至少部分地解釋了AsPC-1細胞中的Antroquinonol介導的抗癌作用。

3 牛樟芝泛醌類組分生物合成研究進展

3.1 泛醌類組分的一般合成途徑及其關鍵酶

3.1.1 泛醌生物合成途徑

泛醌是一類脂溶性醌類化合物，側鏈由不同數目（6～10）異戊二烯單位組成，在各類生物代謝中具有廣泛的功效。從泛醌的結構上來看，它的生物合成（圖3）前體是4-羥基苯甲酸。細菌通過酶消除分支酸的丙酮酸部分來合成，而植物和動物由苯丙氨酸或酪氨酸經4-羥基苯丙烯酸中間體來合成。4-羥基苯甲酸酚羥基在輔酶Q2（CoQ2）的作用下，與一個適當長度的焦磷酸聚異戊二烯酯反應，在其鄰位發生C-烷基化，產物結構可進一步被修飾，如羥基化、O-甲基化、脫羧等，這些反應在真核生物和原核生物中不同；其中，Ubi1、輔酶Q6（CoQ6）和輔酶Q7（CoQ7）的作用是催化途徑中三個單加氧酶反應，而輔酶Q5（CoQ5）的作用則是催化泛醌和甲基萘醌二者合成途徑的甲基化反應。

圖3 泛醌類化合物的生物合成途徑Fig.3 Biosynthesis pathway of ubiquinone compounds

3.1.2 泛醌生物合成途徑中關鍵酶

參與泛醌生物合成的酶類數量多，且催化反應種類多，這就給代謝調控的研究帶來了諸多困難。

1）輔酶 Q2（CoQ2）

輔酶Q2（CoQ2），4-羥基苯甲酸聚異戊二烯轉移酶，是參與CoQ生物合成，將聚丙烯酰側鏈連接到4-羥甲苯甲酸酯環，產生膜結合的第一泛醌中間體。研究表明，該基因的突變將導致CoQ10缺陷，進而阻礙了線粒體氧化作用中的電子傳遞鏈[30]；該基因的突變還會導致致命性嬰兒多系統疾病[31]。

2）輔酶 Q3（CoQ3）

輔酶Q3（CoQ3），O-甲基轉移酶，催化泛醌生物合成的兩個甲基化步驟。CoQ3第一次甲基化發生在途徑內的不同位置，因此涉及不同的底物，并歸類為聚異戊二烯基二羥基苯甲酸酯甲基轉移酶和2-聚異戊二烯基-6-羥基苯酚甲基化酶，第二次甲基化時這兩種酶是共同的，被歸類為3-脫甲基柏木醇-3-O-甲基轉移酶。Poon等[32]研究證明人類CoQ3酶可以恢復CoQ3缺失酵母突變體的泛醌-6的生物合成；Jonassen等[33]研究證實了來自酵母和大鼠的酶也分別催化3-脫甲基柏木醇-6和3-脫甲基柏木醇-9的甲基化。

3）輔酶 Q5（CoQ5）

輔酶Q5（CoQ5），2-甲氧基-6-聚異戊二烯基-1,4-苯并喹啉甲基化酶，參與泛醌生物合成的甲基化步驟，是泛醌生物合成途徑中的C-甲基轉移酶，Dibrov等[34]研究表明將來自釀酒酵母的CoQ5基因導入大腸桿菌后，它能夠補充UbiE突變體的呼吸缺陷。

4）輔酶 Q6（CoQ6）

輔酶Q6，單加氧酶，是泛醌生物合成所必需的進化上保守的單加氧酶，負責泛醌的醌環C5-羥基化。Heeringa等[35]研究發現CoQ6的突變引發腎病綜合癥并伴有神經性耳聾，在小鼠和斑馬魚中的敲除CoQ6基因導致細胞凋亡增加而生長減少。

5）輔酶 Q7（CoQ7）

輔酶Q7，5-脫甲氧基泛醌羥化酶，負責泛醌生物合成中5-脫甲氧基泛醌在5-羥基泛醌中的羥基化。研究顯示該基因突變與壽命延長有關[36-37]；Felkai S等[38]研究發現該基因缺陷減緩各種發育和生理過程，包括細胞周期，胚胎發生，胚胎后生長，節律行為和衰老。

6）UbiD

UbiD，3-辛二酰基-4-羥基苯甲酸羧基裂解酶，是催化3-辛烯基-4-羥基苯甲酸向2-辛二烯基苯酚轉化途徑的酶。UbiD對于合成泛醌是至關重要的。大腸桿菌ubiD突變體會使Q8生物合成產生缺陷，累積4-羥基-3-辛酰基苯甲酸（HP8B），且降低脫羧酶活性[39]。

3.2 牛樟芝泛醌類組分合成途徑探索

牛樟芝泛醌類組分其化學結構與CoQ非常相似，具有類似的母核以及異戊二烯側鏈，在液態發酵中添加CoQ0、對羥基苯甲酸、香葉醇等前體物能夠有效地誘導牛樟芝合成Antroquinonol，通過蛋白質組學分析表明，添加CoQ0 能上調S-腺苷蛋氨酸合成酶的表達，為Antroquinonol 合成提供甲基[40]。4-acetyl-Antroquinonol的合成途徑也與CoQ的合成相關，通過添加對羥基苯甲酸、CoQ0等醌環前體，能夠誘導其合成。通過在發酵中添加13C同位素標記的油酸，結果顯示Antroquinonol和4-acetyl-Antroquinonol-B的醌環上有13C檢出，牛樟芝泛醌類組分可能由苷色酸作為醌環前體，利用聚酮體合成途徑合成[41]。此外，牛樟芝風味成分2,4,5-trimethoxybenzaldehyde和橙花叔醇能夠有效地誘導4-acetyl-Antroquinonol-B合成[42]。

牛樟芝遺傳背景及重要活性成分合成途徑的研究非常薄弱，部分學者對其菌體生長過程中一些調控酶基因以及涉及子實體化的基因進行了研究[43-44]。研究表明CoQ0的轉化率較低，說明轉化過程中存在限速步驟，影響泛醌類組分產量的進一步提高。但是目前對牛樟芝泛醌類組分的合成途徑研究較為欠缺。對于牛樟芝菌絲體而言，深入研究牛樟芝遺傳體系，利用不同組學技術研究自身活性成分（Antroquinonols、Antrodins等）的合成機制，用以提高產量，是非常重要的。

泛醌類組分，包括Antroquinonol、Antroquinonol B和4-acetyl-Antroquinonol B等，在常規液態發酵中是不能合成的，周璇等[45]通過在其中添加前體物CoQ0誘導牛樟芝菌絲體合成Antroquinonol；隨后，在同步萃取發酵時添加植物油，不僅誘導產生了Antroquinonol，還獲得了較多Antroquinonol B。固態發酵菌絲體中可以合成泛醌類物質，然而，牛樟芝菌絲體較為脆弱，在固態發酵過程中不能進行攪拌，否則菌絲斷裂會嚴重抑制菌體生長和代謝。因此，固態發酵的傳至和傳熱會受到嚴重影響，進而限制固態發酵的容器大小和規模，生產效率較低。

4 牛樟芝泛醌類活性成分化學合成研究進展

4.1 Antroquinonol的短時間化學合成

Antroquinonol化學合成法的研究主要開始于近兩年，2015年Hsu等[46]人提出了一種簡單的合成Antroquinonol的方法，利用2,3,4-三甲氧基苯酚經過七步合成Antroquinonol，大大簡化了Antroquinonol化學合成的步驟。

Antroquinonol具有獨特的核心結構4-羥基-2,3-二甲氧基環己-2-烯酮，其帶有4，5 -順式- 5，6 -反式構型的甲基、法尼基和羥基取代基。Antroquinonol的短時間合成由2,3,4-三甲氧基苯酚分七步完成，首先在甲醇中氧化成富含2,3,4,4-四甲氧基環己二烯酮的高電子基質，然后作為關鍵步驟與二甲基醚進行Michael反應，隨后進行烷基化、還原和差向異構化，在3個連續的立體中心處加入所需的取代基。

4.2 Antroquinonol D的化學全合成

2014年Sulake等[47]人通過4 -甲氧基苯酚實現了Antroquinol D的全合成。此外，研究了二甲氧基環己二烯酮的邁克爾加成。主要步驟涉及螯合和基質控制環己酮的非對映體選擇性還原和內酯化。內酯合成促進了酮的非對映選擇性還原，合成中的其他關鍵反應包括丙二酸二甲酯在環己二烯酮上的邁克爾加成，二羥基化和Wittig烯化。

2015年Sulake等[48；49]人又對樟芝泛醌類活性成分的全化學合成方法進行了相關的報道,描述了Antroquinonol和Antroquinonol D的第一次全合成。該路線的特征是銥催化的烯烴異構化-克萊森重排反應（1CR），內酯化和Grubbs烯烴復分解。通過硒化/氧化方案和消除β-甲氧基來實現所需的α, β-不飽和度，以提供來自共同中間體的兩種天然產物。

5 存在問題及展望

本文綜述了近年來以Antroquinonol為代表的牛樟芝中泛醌類活性成分的研究，發現了其擁有的生物活性比如保肝、抗炎及抗癌活性等，為開發出治療人類疾病的有效藥物奠定了基礎。

由于牛樟芝的珍稀及泛醌類物質的微少產量已經遠遠不能滿足人類的大量需求，因此，促進牛樟芝生長和泛醌類物質合成的研究刻不容緩。泛醌類組分的合成主要包括化學合成法和微生物發酵法兩種方式。其中關于化學合成法的研究主要開始于近兩年，但是現有的Antroquinonol類化學合成方法的步驟復雜、總收率低以及產品純度低，很難實現工業化的生產。

通過微生物發酵的牛樟芝菌絲體培養物與子實體特征活性成分雖然相差較大，但是其特有的泛醌類化合物以及Antrodins類等化合物有效地補充了菌絲體產物的不足，更重要的是菌絲體培養能夠實現大規模工業化生產，因此，我們應著力于微生物調控，實現泛醌類活性成分的大量獲得。