實踐十號搭載白色念珠菌的代謝組學分析

趙光顯，王佳平，劉 宇，高建義，辛冰牧，王 珩，李勇枝

(中國航天員科研訓練中心，北京100094)

1 引言

近年來，空間微生物安全問題已成為相關領域的研究熱點。 白色念珠菌是一種常見的條件性致病菌，常寄生于人體皮膚表面、口腔、胃腸道以及外生殖系統內[1]，當外界環境發生變化時，其致病性往往會發生變化。 無論是在阿波羅號飛船的航天員身上[2]，還是在和平號空間站和國際空間站艙內[3]，均發現了白色念珠菌的存在。 而在太空飛行環境下人體免疫力會降低[4-5]，白色念珠菌的存在對航天員的健康構成了潛在威脅。 雖然近年來有一些研究表明包括白色念珠菌在內的一些致病微生物空間環境下的生長繁殖加快[6-9]、毒性增強[10-11]，但其生物學性狀變化的深層機制目前仍不十分清楚，尤其在代謝機制方面研究較少，亟待深入研究[12-13]。

代謝組學是近年來繼基因組學和蛋白質組學之后新興的一門學科，主要通過組群分析對生物細胞中全部低分子質量代謝產物進行定性、定量分析，闡釋內外因素的作用下產生的代謝物質的動態變化[14]。 代謝組學根據實驗目的可分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學。 靶向代謝組學是檢測特定種類內源性代謝物的實驗方法，而非靶向代謝組學是檢測整個生物體內源性代謝物的實驗方法，其能系統地闡釋生物體內內源性代謝物的變化規律。 非靶向代謝組學中的高效液相色譜-飛行時間質譜技術(High Performance Liquid Chromatography Quadrupole-Time of Flight Mass Spectrometry， UPLC-QTOF/MS)具有高靈敏度、高分辨率、高分離率等特點，可對生物代謝產物的分析結構及質量信息能進行精確分析，目前已在生命科學的研究中廣泛應用[15]。

本實驗通過UPLC-QTOF/MS 分析鑒定實踐十號衛星搭載白色念珠菌的顯著差異生物代謝物，通過分析特征性代謝物的代謝通路，闡釋太空環境可能對白色念珠菌生物學性狀的影響。

2 實驗材料

2.1 菌株

白色念珠菌[Candida albicans，CMCC(F)98001]，購自中國醫學細菌微生物菌種保藏管理中心。

2.2 培養基

沙氏液體培養基(OXIOD 公司，CM0147)組成：葡萄糖20 g/L，動物組織胃蛋白酶水解物5 g/L，胰酪胨5 g/L。

2.3 主要試劑

甲醇(Fisher Scientific 公司，A456-4)，PBS 溶液(Gibco 公司，C20012500BT)，氮氣(氮氣發生器產生)。

2.4 主要儀器及耗材

超快速液相色譜：Acquity UPLC，Waters 公司；震蕩混勻器：Mix-3000，杭州米歐儀器有限公司；四極桿飛行時間質譜：Xevo G2-Si，Waters 公司；臺式高速冷凍離心機：Mikro 220R，Hettich 公司；超聲波振蕩器：KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司；反向色譜柱：ACQUITY UPLC CSH C18，Waters 公司；2 mL 進樣瓶：5320，DIKMA 公司；1.5 mL離心管：Axygen MCT-150-C，Corning 公司；250 μL 內插管： VDAP-4025-6297E-100， ANPEL公司。

2.5 主要分析軟件

Masslynx 4.1 質譜數據采集軟件，Waters 公司；Progenesis QI 2.1 代謝組數據處理軟件，Nonlinear Dynamics 公司；Simca 14.1 統計分析軟件，Umetrics 公司。

3 實驗方法

3.1 搭載菌株的培養

將白色念珠菌培養到對數生長期OD600nm＝1.0 的菌液20 μL 接種到沙氏葡萄糖半固體培養基，30 ℃恒溫培養30 h 后，一部分搭載實踐十號返回式科學實驗衛星，太空飛行12 d，回收后-20 ℃甘油保存菌種，一部分在地面常規培養設立對照組。

3.2 樣本制備

首先，將實踐十號衛星搭載的白色念珠菌菌株和地面常規對照組菌株在沙氏葡萄糖平板上30 ℃過夜活化，將活化的兩組菌株取少量接種于沙氏液體培養基中30 ℃振蕩培養(150 r/min)至對數中期(OD600nm＝1.0)時停止培養，4 ℃離心5 min(4000 r/min)，棄上清，無菌PBS 溶液沖洗菌液，同條件離心5 min，棄上清，再次用無菌PBS溶液沖洗菌液，再離心，重復沖洗3 次后最后離心收集菌沉淀于1.5 mL 的樣品離心管中-80 ℃保存。 其次，將離心管中菌沉淀樣本在4 ℃條件下融化30 ～ 60 min，加入300 μL 甲醇，超聲振蕩提取10 min。 最后，將離心管中液體充分振蕩15 s，然后在4 ℃條件下用離心機離心10 min(12000 r/min)，離心完畢后取上層溶液100 μL，加入200 μL的內襯管中以待后續檢測。

3.3 UPLC-QTOF/MS 檢測

UPLC-QTOF/MS 檢測首先使用高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography， UPLC)分離菌液樣本代謝物；其次運用四極桿飛行時間質譜進行一二級質樸掃描，模式為全信息串聯質譜模式(MSE)，得出母離子與碎片離子相關質譜信息；然后運用主成分分析(Principal Component Analysis， PCA)及正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis， OPLS-DA)對2 組樣本的差異代謝物進行定性分析，根據一二級質譜得出代謝物的質荷比、保留時間、特征性碎片離子信息匹配公共數據庫找出組間的潛在顯著差異生物代謝物。

3.3.1 反相色譜分離條件

色譜柱(waters UPLC HSS T3)的規格：1.8 μm*2.1 mm*100 mm。

流動相條件。 A：水，0.1%甲酸；B：乙腈，0.1%甲酸；流速：0.3 mL/min；進樣量：1.0 μL；柱溫：45 ℃。 具體洗脫程序見表1。

表1 C18 反相色譜離子測定洗脫程序Table 1 The gradient conditions for reversed phase C18 separation for ion

3.3.2 質譜條件

運用四極桿飛行時間質譜進行質譜信息采集，采集使用電噴霧離子源(ESI)正負離子模式，碰撞氣、翹氣以及輔助氣均為氮氣，應用Masslynx4.1 軟件進行數據采集和處理，質譜檢測模式為MSE模式，其通過高低2 種能量交替掃描的方式得到代謝物一二級質譜相關數據。 具體條件見表2。

表2 質譜條件Table 2 Mass spectrometry condition

3.3.3 質量控制

質量控制是評價質譜系統能否得到重復性好且準確性高的差異代謝物的重要環節。 根據保留時間、質量準確度和信號強度這3 個可能影響質量的因素，本實驗首先采用5 個空白樣本平衡色譜柱，再采用3 個質控樣本平衡柱條件。 每間隔3 個樣本柱加入1 個質控柱用于監測系統的重復性和穩定性，剔除變異系數超過15%的特征值以確保數據準確可靠。

3.3.4 非靶向代謝組數據處理

無論是正離子還是負離子模式，均用Progenesis QI 軟件處理所有采集好的數據并作圖(峰提取強度調整為模式1)。 運用Simca 軟件對采集的離子數據進行PCA 分析及OPLS-DA 分析。PCA 分析及OPLS-DA 分析的條件如下：

1)PCA 分析。 為了判別搭載組白色念珠菌代謝物與地面對照組是否具有組間差異，本實驗首先采用無監督的PCA 建模方法對2 組進行分析。 R2X 代表模型的解釋率，Q2代表了模型的可預測變量。 2 種掃描模式的PCA 模型的參數見表3。

表3 2 組比較主成分分析模型參數Table 3 Comparison of PCA model parameters

2)OPLS-DA 分析。 為獲得有顯著差異的代謝物信息，以探究太空飛行對白色念珠菌引起的代謝變化，從而找到潛在的生物標志物，本實驗在進行PCA 分析后，采用有監督的OPLS-DA 分析對代謝數據重新進行建模。 OPLS-DA 分析可減小其他因素干擾，剔除無關分類變量，從而放大組間差異，得到更好的分類效果。 本實驗將OPLSDA 模型的變量重要性值(Variable Importance in the Projection，VIP)定為大于1，通過ANOVA 分析(P＜0.05)找出相關差異生物標志物。 組間顯著差異生物標志物通過以下方式定性：搜索公共數據庫(METLIN、LIPID MAPS、PUBCHEM、YMDB以及KEGG)等，比較質譜的質荷比，誤差限制0.01 Da，然后根據其保留時間以及二級圖譜中特征性碎片離子輔助定性鑒別，并找出其可能的代謝途徑。

使用OPLS-DA 模型對2 組樣本進行統計分析，R2Y(模型的解釋率)及Q2值(模型的預測率)可判別模型的質量好壞。 本實驗的模型參數見表4。

表4 2 組比較OPLS-DA 模型參數Table 4 Comparison of OPLS-DA model parameters

表4 說明該模型在正離子狀態下有97.5%的可能性解釋2 組樣本的差異性，負離子狀態下有90.1%的可能性解釋2 組樣本的差異性。 以上參數說明數據的擬合度比較好，可滿足OPLS-DA 的建模要求。

4 實驗結果

4.1 質控評估結果

PCA 分析結果如圖1～2 所示。 圖1 為反相色譜正離子PCA 質控得分圖，圖2 為反相色譜負離子PCA 質控得分圖。 圖中每一個綠色圓圈代表1 個質控樣本(qc)，每一個藍色三角符號為1個空白樣本(sample)，橢圓內代表95%可信區間，橫縱坐標代表不同主成分積分值。 由圖1～2 可以看出正負離子模式的質控樣本都聚集在了一起，這說明質譜系統的穩定性和準確性很好，可以進行下一步實驗研究。

圖1 正離子質控評估(PCA 得分圖)Fig.1 Quality control sample evaluation of positive ions(PCA scores)

圖2 負離子質控評估(PCA 得分圖)Fig.2 Quality control sample evaluation of negative ions(PCA scores)

4.2 總離子流圖比較

圖3 正離子總離子流圖Fig.3 Total ion current chromatogram of positive ions

圖4 負離子總離子流圖Fig.4 Total ion current chromatogram of negative ions

各組反相色譜正離子、負離子的總離子流圖如圖3～4 所示。 每幅圖的上圖為搭載組離子流圖，下圖為地面對照組離子流圖。 每幅圖橫坐標為保留時間，縱坐標為相對峰強度百分比。 其中正離子提峰759 個，負離子提峰有706 個。 從正負離子的總離子流圖可以看出，搭載組和地面對照組白色念珠菌存在很多相同的代謝物，但根據代謝物峰值初步判斷一些代謝物在量上存在一定差異。

4.3 兩組樣本差異代謝物顯著性分析

4.3.1 PCA 分析結果

2 組樣本PCA 得分圖如圖5～6 所示。 圖5代表正離子PCA 得分圖，圖6 代表負離子PCA得分圖，圖中每一個綠色圓圈符號代表1 個搭載組樣本(space flight)，每一個三角符號代表1 個地面對照組樣本(control)。 橫縱坐標依次分別為第一、第二主成分得分值。 橢圓內代表主成分積分值95%可信區間范圍。 從圖5～6 可以看出，無論是正離子PCA 得分圖，還是負離子PCA 得分圖，2 組代謝物均在可信區間內，差異并沒有明顯分離，但可反映出代謝譜有組間差異。 需進一步進行OPLS-DA 分析。

圖5 正離子PCA 得分圖Fig.5 PCA scores of positive ions

4.3.2 OPLS-DA 分析結果

圖6 負離子PCA 得分圖Fig.6 PCA scores of negative ions

OPLS-DA 得分圖(Scores plot)如圖7～8 所示。 圖7 代表正離子OPLS-DA 得分圖，圖8 代表負離子OPLS-DA 得分圖，圖中每個圓圈符號代表每個搭載組樣本，每個三角符號代表每個地面對照組樣本。 橢圓內代表OPLS-DA 積分值95%可信區間范圍。 橫縱坐標表示OPLS-DA 相關積分參數。 從正、負離子OPLS-DA 得分圖可以看出搭載組樣本和地面對照組樣本被顯著劃分為2 群，表明代謝譜有明顯的組間差異。

圖7 正離子OPLS-DA 得分圖Fig.7 OPLS-DA scores of positive ions

表5 組間顯著差異生物標志物及可能的代謝途徑Table 5 Significantly different biomarkers and possible metabolic pathways

圖8 負離子OPLS-DA 得分圖Fig.8 OPLS-DA scores of negative ions

4.4 組間顯著差異生物標志物的鑒定

通過對OPLS-DA 模型中VIP＞1 的代謝物進行篩選，結合ANOVA 分析(P＜0.05)共找出7 種差異生物標志物，其中正離子模式下有2 種，負離子模式下有5 種，根據其一二級質譜信息匹配公共數據庫得到的差異生物代謝物名稱、分子式及相關代謝途徑如表5 所示，由表可以看出這7 種差異生物代謝物與能量代謝、甘油磷脂代謝以及脂肪酸代謝密切相關。 定量分析如圖9～10 所示，從差異生物標志物箱形圖中可以看出這7 種菌類代謝物的含量發生了明顯改變，其中搭載組白色念珠菌與地面對照組相比，含量上升的有3種代謝物(圖9)，分別是5′-甲硫腺苷(5′-Methylthioadenosine)、腺苷酸代琥珀酸(Adenylsuccinic Acid)和磷脂酰甘油PG(16：0/18：1(11Z))。 含量下降的有4 種代謝物(圖10)，其種3 種溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE)含量下降，還有一種不飽和脂肪酸蓖麻油酸(Ricinoleic Acid)含量下降。

5 討論

圖9 在搭載組含量上升的3 種生物標志物箱形圖Fig.9 Box-plot of 3 biomarkers with increased contents in spaceship-carried group

圖10 在搭載組含量下降的4 種生物標志物箱形圖Fig.10 Box-plot of 4 biomarkers with decreased contents in spaceship-carried group

本研究中，搭載組白色念珠菌與地面對照組相比，共發現了2 種與能量代謝相關的潛在生物標志物代謝上調，一種是5′-甲硫腺苷，另外一種是腺苷酸代琥珀酸。 5′-甲硫腺苷廣泛存在于原核生物、真核生物、植物及高等生物中間，5′-甲硫腺苷中的甲基是由蛋氨酸來提供，剩下的部分分子是由ATP來提供，有研究表明5′-甲硫腺苷與生物的能量代謝與增殖密切相關[16]。 腺苷酸代琥珀酸是AMP和GMP 的生成過程中一種重要的代謝中間物，參與生物能量代謝與三羧酸循環。 搭載組白色念珠菌5′-甲硫腺苷和腺苷酸代琥珀酸代謝水平增加高度提示搭載組能量代謝旺盛，潛在的增殖水平可能提高。 謝瓊等[7]用航天器搭載白色念珠菌在軌飛行7 天，發現搭載組比地面對照組存活增長率明顯提高；江文俊等[17]也在模擬失重條件下發現白色念珠菌的增殖速率加快。 Crabbe 等[18]在NASA 執行STS-115 任務期間搭載了白色念珠菌，發現在太空搭載環境可促進白色念珠菌的隨機出芽，這也間接說明了在太空環境下白色念珠菌的能量代謝水平相對旺盛。

其次，在甘油磷脂代謝中1 種磷脂酰甘油PG(16：0/18：1(11Z))在搭載組顯著上升。 磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol， PG)存在于生物的細胞膜和線粒體膜中，是合成心磷脂的前體[19]，而心磷脂在線粒體內膜中對維持線粒體的能量代謝具有至關重要的作用，它可促進線粒體中氧化呼吸鏈的電子傳遞[20]。 PG 本身也有研究表明在線粒體缺陷的酵母細胞中對線粒體功能的修復有重要影響[21]。 搭載組PG 含量的顯著上升提示搭載組白色念珠菌細胞線粒體能量代謝相對旺盛，這與之前5′-甲硫腺和腺苷酸代琥珀酸苷含量上升的分析結果相一致，即太空搭載環境提高白色念珠菌的能量代謝水平。

另外，在甘油磷脂代謝中3 種溶血磷脂酰乙醇胺(表5 中LysoPE)的含量略有下降。 從溶血磷脂代謝通路分析推斷搭載組3 種溶血磷脂酰乙醇胺含量下降可能與白色念珠菌部分磷脂酶B高表達有關。 有研究表明，在真菌細胞中磷脂酶B 具有溶血磷脂酶-轉酰基活性，其溶血磷脂酶活性可水解溶血磷脂，其轉酰基活性可將細胞中游離脂肪酸轉移到溶血磷脂中生成磷脂[22]。 3 種LysoPE 屬于溶血磷脂，可能正是部分磷脂酶B 這種雙重高表達活性的綜合作用才導致了3 種LysoPE 在搭載組含量下降。 而磷脂酶B 是致病真菌中廣泛存在的毒力因子[23]，磷脂酶B 表達活性增強，白色念珠菌毒力隨之提高[24-25]。 因此3 種LysoPE 含量下降提示搭載組白色念珠菌毒力可能增強。 在模擬微重力條件下用白色念珠菌對小鼠進行毒力實驗，發現模擬微重力組白色念珠菌對小鼠的致死能力提高，對巨噬細胞破壞增強[26]。 多個研究表明[27-28]失重環境可促進白色念珠菌由酵母相向菌絲相轉變，而白色念珠菌的菌絲相對人體更具侵襲力，毒力更強[29-31]。

最后，本實驗發現一種叫蓖麻油酸(Ricinoleic acid)的不飽和脂肪酸含量下降。 目前研究發現蓖麻油酸是念珠菌多功能膜脂肪酸去飽和酶CpFad2 的產物[32]，參與念珠菌細胞膜不飽和脂肪酸代謝，但其在細胞中的功能目前還不十分清楚。 搭載組蓖麻油酸含量下降提示搭載組脂肪酸代謝水平下調，相反提示能量代謝相關通路代謝水平可能上調，從而印證搭載組能量代謝水平提高。

6 結論

本研究共發現了7 種差異生物標志物，與對照組相比，搭載組5′-甲硫腺苷、腺苷酸代琥珀酸以及磷脂酰甘油3 種能量代謝物含量上調，1 種不飽和脂肪酸蓖麻油酸含量下調提示太空搭載環境可顯著提高白色念珠菌能量代謝水平，其潛在增殖水平可能提高；3 種溶血磷脂酰乙醇胺在搭載組含量下調提示搭載組白色念珠菌磷脂酶B高表達活性，磷脂酶B 是真菌中廣泛存在的毒力因子，這提示太空搭載環境可使白色念珠菌的毒性水平增加。

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