基于電噴霧-四極桿-飛行時間質譜的神經節苷脂的結構解析

張華林 郭志謀 王聯芝 金高娃 鄒麗紅 呂園園 馬明輝 閆競宇 段正超 梁鑫淼

摘?要?神經節苷脂（Ganglioside）是一種含有唾液酸的鞘糖脂化合物，是脊椎動物細胞膜的天然成份，具有廣泛的生理功能。對神經節苷脂進行結構鑒定，有助于深入了解藥物的組成，提高藥物的品質，但由于神經節苷脂結構復雜，異構體眾多，質譜規律變得多樣且復雜。本研究建立了一種利用電噴霧-四極桿-飛行時間質譜的（ESI-Q-TOF-MS）解析神經節苷脂結構的方法。通過兩個神經節苷脂對照品，優化質譜參數并總結質譜規律，建立質譜方法為：正離子模式; 3500 V毛細管電壓; 200 V Fragmentor電壓; 用40 eV的碰撞能獲得糖鏈的碎片結構， 用80 eV的碰撞能獲得神經酰胺的碎片結構。將本方法應用于制備的9個神經節苷脂的結構解析中，通過與對照品分子量對比，對樣品進行簡單的歸屬和分類，再根據樣品的二級質譜中的特征碎片進行詳細的結構解析。本研究結果表明，本方法可用于各類神經節苷脂的質譜鑒定中，為更復雜的神經節苷脂質譜解析奠定了基礎。

關鍵詞?神經節苷脂; 電噴霧-四極桿-飛行時間質譜; 結構解析

1?引 言

神經節苷脂（Ganglioside）是一類含有唾液酸的鞘糖脂化合物，最初是由E.Klenk在患家族黑蒙性癡呆病（Tay-Sachs）的幼兒大腦中發現。由于在腦灰質細胞中含量最高，于是將這類含唾液酸的鞘糖脂命名為神經節苷脂。神經節苷脂在正常細胞的生長、分化、調節及信息傳遞過程中發揮著重要作用，尤其是在神經元的成熟和損傷神經的修復再生過程中的作用備受關注，同時，神經節苷脂在臨床上也具有很高的價值[1～5]?，如治療帕金森病、阿爾茲海默病、亨廷頓病等神經性疾病。神經節苷脂由親水性的寡糖鏈部分和親脂性的神經酰胺（Ceramide，Cer）組成。寡糖鏈的單糖種類常包括D-葡萄糖（Glucose，Glc）、D-半乳糖（Galactose，Gal）、N-乙酰氨基半乳糖（N-acetylgalactosamine， GalNAc）、巖藻糖（Fucose，Fuc）和唾液酸（N-Acetylneuraminic acid，NeuAc）。神經酰胺結構中包含一條脂肪酸鏈（Fatty acid chain）和一條鞘氨醇鏈（Sphingosine）。不同的單糖組成、數目和神經酰胺鏈的長度組成了一系列神經節苷脂類化合物，據報道，在人腦病變組織中已發現和鑒定了73種神經節苷脂[6]。為更加簡單表述這類物質，Svennerhnolm創立了一個通俗命名規則[7]。G代表神經節苷脂，大寫A、M、D、T、Q、P、H和S分別表示所含的0～7個唾液酸基團數目，數字為5與糖基數之差，小寫字母a，b，c表示唾液酸不同的連接位置。神經酰胺的結構通常在糖鏈后的括號內注明，如GM1（d 18∶1/18∶0），字母d表示在神經酰胺中有2個羥基，18∶1描述的是鞘氨醇的結構，表示在鞘氨醇中有18個碳原子和1個雙鍵，18∶0是脂肪酸鏈的結構，表示在脂肪酸鏈中有18個碳原子且沒有雙鍵。本研究為了方便表示化合物結構，神經酰胺部分直接以該部分的分子量表示，如GM1（565）表示該單唾液酸四己糖神經節苷脂的神經酰胺部分的分子量為565。

電噴霧-四極桿-飛行時間質譜（Electrospray ionization-quadrupole-time of flight mass spectrome，ESI-Q-TOF-MS）具有分辨率高、采樣速度快的優點，全掃描方式檢測的離子質量準確度比一般的質譜高100倍以上[8]，在推斷化合物結構方面具有無可比擬的優勢，并且能選定一級質譜中的目標物進行二級質譜分析，更有利于解析化合物的結構。目前已有許多采用液相色譜-質譜聯用的方法分析神經節苷脂的報道[9～21]。2010年，Zarei等[10]利用納升高效液相色譜（nanoHPLC）和電噴霧-四極桿-飛行時間質譜（ESI-QTOF/MS）在線結合，用于分析YAC-1淋巴瘤細胞單唾液酸神經節苷脂，發現YAC-1細胞系可表達GM1b和GalNAc-GM1b類型的神經節苷脂。2012年，Lee等 [11]利用納升液相色譜-芯片/質譜（nano-HPLCchip Q-TOF/MS）建立了極性脂質分析方法，分析了小鼠腦的極性脂質，發現其含有17種神經節苷脂和13種硫苷脂。2017年，Hajek等 [22]將親水相互作用液相色譜（HILIC）與負離子電噴霧電離串聯質譜（ESI-MS/MS）方法相結合，用于豬腦、人腎、肺、血漿和紅細胞中的神經節苷脂的分析，鑒定了145種神經節苷脂，該方法具有通量高、靈敏度高等優點。盡管這些研究在神經節苷脂分析中取得了較好的進展，但多數研究集中在利用該方法對動物或人的器官和組織中神經節苷脂的輪廓分析，利用Q-TOF方法研究神經節苷脂的質譜碎裂規律的工作未見文獻報道。本研究利用兩個已知結構的神經節苷脂對照品進行質譜條件的優化及特征碎片的歸屬研究，在此基礎上，對制備得到的一系列的神經節苷脂進行質譜結構解析和鑒定，最后對神經節苷脂的斷裂規律進行了總結，為解析復雜的神經節苷脂結構提供了理論依據。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Agilent 1290 infinity和6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS（Agilent Technologies公司），質譜數據分析軟件采用Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis B.04.00; XS105天平（Dual Range公司）。

甲醇（色譜純，Merck公司）; 乙腈（色譜純，Sigma公司）; 氯仿（分析純，天津市凱信化學工業有限公司）; 神經節苷脂對照品GM1（d18∶1/18∶0）和GM1（d18∶1/20∶0）由齊魯制藥有限公司提供，純度≥99%; 其余神經節苷脂樣品由實驗室自制，純度≥98%。實驗用水為Milli-Q超純水。

2.2?實驗方法

準確稱取各單體1 mg， 溶于1 mL氯仿-甲醇-水（25∶25∶8， V/V）中，取出100 μL，再用900 μL氯仿-甲醇-水（25∶25∶8， V/V）稀釋， 配制成100 μg/mL的溶液。（1）液相色譜條件?流動相為0.1%甲酸-乙腈（50∶50，V/V），流速0.2 mL/min，進樣量為0.5 μL（無色譜柱，二通連接）。（2）質譜條件?正離子模式，毛細管電壓為3500 V，干燥氣溫度為350℃， 氣體流速為8.0 L/min。Fragmentor電壓參數的設置參見結果與討論部分。一級質譜掃描范圍為m/z 300～2000，二級質譜的掃描范圍為m/z 100～2000。在開展質譜的二級碎裂時，手動設定一級質譜獲得的豐度最高的質荷比為前體離子，通過改變不同的碰撞能進行譜圖優化。

3?結果與討論

3.1?神經節苷脂分子量的測定及結構的簡單歸屬

神經節苷脂結構復雜，結構相似物多，分離純化存在較大的挑戰，本實驗室在前期工作中通過多維制備液相色譜從豬腦粗提物中分離得到系列單體化合物。本研究選擇其中具有代表性的9種化合物，利用一級質譜對其進行分子量測定，通過與對照品GM1（565）和GM1（593）分子量比對，根據分子量的變化進行簡單的歸屬和分類。如樣品的分子量與對照品分子量差值為291及291的倍數，認為是唾液酸數目的增減; 與對照品分子量相差146及146的倍數，認為是巖藻糖數目的增減; 與對照品的分子量相差14及14的倍數，則可能是脂鏈部分發生了變化。表1給出了本研究涉及的11種神經節苷脂化合物的信息。化合物1和2分別為兩個單唾液酸四己糖神經節苷脂對照品GM1（565）和GM1（593）。化合物3～7與對照品相比，分子量的差異大，且除化合物3外都是唾液酸數目的增減，可根據之前的命名規則將其直接歸屬，其中化合物5和6是同分異構體，分別用后綴區分兩種化合物。化合物3與GM1（593）相比，相差146，推測是糖鏈部分增加了一個巖藻糖。化合物8～11與對照品分子量差異小，不可能是糖鏈的結構差異引起的，因此推測其神經酰胺部分發生了變化。

3.2?質譜條件的優化

3.2.1?優化質譜離子模式?在質譜分析中，尤其是二級質譜，質譜條件的設置對于獲取特征碎片信息具有重要影響，因此針對所使用的質譜特點，優化質譜參數，獲得更多的碎片信息是本研究優先考慮的問題。本研究采用Agilent Technologies 6540質譜儀，對毛細管電壓、離子模式、碎裂電壓和碰撞能等重要參數進行優化。

首先對質譜離子模式進行優化，結果見電子版文后支持信息圖S1A和S1B，負離子模式獲得的離子碎片明顯少于正離子模式獲得的碎片。考慮到碰撞能的影響，加大碰撞能到80 eV（電子版文后支持信息圖S1C和S1D），正離子模式下所獲得的離子碎片明顯比負離子模式下獲得的離子碎片多。由此確定，在正離子模式下會獲得更多的離子碎片峰，更有利于對神經節苷脂的結構解析。

3.2.2?優化碎裂電壓?考察了GM1（565）在不同的碎裂電壓下的電離和碎裂情況，結果如電子版文后支持信息圖S2所示，在正離子模式、毛細管電壓為3500 V、碰撞能為40 eV，以及進樣量一致的條件下，碎裂電壓為30、50和100 V時，母離子m/z 1568.9（加鈉峰）的豐度都偏低; 碎裂電壓為150、175和200 V時，母離子豐度比較適中，且差異很小。本實驗選擇碎裂電壓為200 V的條件下，對神經節苷脂進行裂解。

3.2.3?碰撞能的優化?二級質譜是通過選擇特定質荷比（m/z）的母離子，在儀器中利用誘導碰撞電壓（CID）進行碎裂，得到二級質譜圖。碰撞電壓過小，會使母離子斷裂不夠明顯，獲得的碎片少、豐度低，影響化合物推斷; 碰撞電壓過大，碎裂過于嚴重，也不利于解析結構。神經節苷脂結構中包含易發生碎裂的糖鏈結構和不易碎裂的神經酰胺結構，希望通過調整碰撞能既可獲得糖鏈的結構也可獲得神經酰胺結構，因此，對碰撞能進行了詳細的優化。

為了觀測到神經節苷脂中糖鏈的結構組成，采用對照品GM1（565）在正離子模式、毛細管電壓為3500 V、碎裂電壓為200 V、進樣量一致的條件下，分別考察碰撞能為20、30、40 和50 eV時糖鏈碎片的豐度，結果如電子版文后支持信息圖S3所示。在碰撞能為20 eV和30 eV時，母離子m/z 1568.9（加鈉峰）豐度較高，其余各碎片離子豐度較低; 當碰撞能增加至40和50 eV時，母離子m/z 1568.9（加鈉峰）豐度顯著降低，故本研究選取40 eV的碰撞能對糖鏈進行檢測。神經節苷脂中不易碎裂的神經酰胺結構需要在較高的碰撞能下才能裂解[26]，分別考察碰撞能為60、70、80和90 eV時的結果（如電子版文后支持信息圖S4所示），神經酰胺（m/z 548）的豐度隨著碰撞能增加，碎片離子m/z 264的豐度逐漸增加，m/z 548的豐度逐漸降低，故最終選取80 eV作為碎裂神經酰胺的碰撞能。

對質譜各參數影響的考察后，確定測定神經節苷脂的質譜條件為正離子模式，毛細管電壓為3500 V， 碎裂電壓為200 V，用碰撞能40 eV的測定糖鏈的結構，用80 eV的碰撞能測定神經酰胺的結構。

3.3?對照品質譜碎片歸屬

3.3.1?GM1（565）質譜碎片歸屬?由神經節苷脂的結構可知，GM1的糖鏈部分含1個唾液酸和4個單糖組成。

為方便進行質譜推斷，圖1標識了對照品GM1（565）（即GM1（d18∶1/18∶0））結構中各組成部分的分子量[9]。在優化條件下，GM1（565）在40和80 eV碰撞能下的實驗譜圖見圖2。在40 eV碰撞能下（圖2A），可依次看到分子離子峰、失掉唾液酸和糖單元的峰及神經酰胺失水峰等，這些特征碎片很好的展示了糖鏈結構。在80 eV碰撞能下（圖2B），除糖鏈部分的結構外， 有個較為明顯的碎片峰為m/z 264， 通過查閱文獻[24，25]，其形成與鞘氨醇結構有關（表2中R所示），通過其碎片可推測出神經酰胺的結構。表2詳細歸屬了GM1（565）在優化質譜條件下產生的碎片結構。

3.3.2?GM1（593）質譜碎片歸屬?為進一步考察神經節苷脂在此條件下的裂解規律，再次用另一個對照品GM1（593）進行驗證。圖S5A顯示，在40 eV碰撞能下，GM1（593）譜圖與GM1（565）譜圖一致，說明二者都含有單唾液酸四己糖結構。圖S5B中清晰可見m/z 264峰，說明神經酰胺中鞘氨醇的結構兩個對照品是一致的，主要差異來源于脂肪酸鏈的不同，與GM1（565）相比，GM1（593）在脂肪酸鏈上有兩個碳的延長，其余結構都一致。推測結果與GM1（593）的實際結構完全一致，表明本方法可用于神經節苷脂類物質的結構推測。電子版文后支持信息表S1對GM1（593）的主要碎片進行了歸屬。

3.3.3?解析糖鏈發生變化的神經節苷脂?通過一級質譜可知，化合物3～7與GM1（593）相比，主要是糖鏈上發生了變化。以高碰撞能對這些化合物進行裂解，發現其神經酰胺產生的碎片結構與GM1（593）一致，均為d18∶1/20∶0的結構，再一次證明主要差異來自于糖鏈部分。在優化后的條件下，上述神經節苷脂的糖鏈質譜以及對照品GM1（593）糖鏈部分譜圖見圖3A。在糖鏈變化中比較容易推斷結構的是糖數目和種類的變化，如GA1（593）（圖3B）和Fuc-GM1（593）（圖3C），較難推斷的是異構體及多個唾液酸時唾液酸的連接位置和連接方式，在本研究中將重點討論異構體GD1（593）-1（圖3D）和GD1（593）-2（圖3E）異構體的結構推斷，以及GT1（593）中3個唾液酸的連接位置和方式。對比圖3D和3E，譜圖差異性較大，在圖3E中m/z 583碎片是2個唾液酸通過α-2，8連接鍵首尾相連的特征碎片，說明GD1（593）-2中2個唾液酸是在連在一起的，結合其它碎片，可進一步歸屬其為GD1b的糖鏈結構。在圖3D中未發現m/z 583特征碎片，說明兩個唾液酸未連在一起，同時m/z 657顯示其中1個唾液酸與末端半乳糖相連，由此推斷出GD1（593）-1中糖鏈的結構為GD1a。同理可以推測出GT1（593）中的糖鏈結構為GT1b。上述糖鏈變化的神經節苷脂糖鏈碎片歸屬及推測得到的化合物精確結構見表3。

3.4?解析神經酰胺鏈發生變化的神經節苷脂

如前所述，推測神經節苷脂化合物8～11與對照品相比主要是神經酰胺部分發生了變化。通過標準品質譜裂解規律可知，在80 eV的碰撞能下，可根據鞘氨醇鏈的特征碎片m/z 264推斷出神經酰胺的結構。4種化合物的該部分結構的質譜見圖4。在圖4A和4B中均可見特征碎片m/z 264，說明GM1（607）和GM1（621）的鞘氨醇鏈未變化，神經酰胺結構的改變主要發生在脂肪酸鏈上的碳數目的延長上。在圖4C和4D中未見m/z 264特征碎片，但都有m/z 284的未知碎片，同時，GM1（567）、GM1（595）與對照品GM1（565）、GM1（593）相比，分子量分別增加了2，推測其是鞘氨醇部分的雙鍵被還原。通過與文獻[26， 27]比對，m/z 284確定為鞘氨醇鏈的雙鍵被還原后產生的特征碎片，具體結構見圖4，表4列出了神經節苷脂8～11的特征碎片的精確結構。

4?結 論

建立了一種基于ESI-Q-TOF-MS的神經節苷脂類化合物結構解析方法。在優化條件下獲取對照品的特征碎片及裂解規律，進而將此裂解規律應用到制備得到的9種神經節苷脂的結構解析中。制備得到的神經節苷脂與對照品相比，有些化合物在糖鏈部分發生了變化，例如唾液酸和巖藻糖的個數、位置的變化，有些化合物在神經酰胺鏈上發生了變化，如脂肪酸鏈碳數目和鞘氨醇鏈飽和程度，均具有一定的代表性。在對這些化合物質譜解析中，發現和總結了不同類型神經節苷脂獨特的結構碎片，為更復雜的神經節苷脂的質譜解析奠定了基礎。

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